姜黃素干預(yù)TNF-α誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)FKN的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究腫瘤壞死因子-α（TNF-α）對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）表達(dá)不規(guī)則趨化因子（FKN）的影響，以及姜黃素對(duì)其干預(yù)作用，以期進(jìn)一步了解FKN在動(dòng)脈粥樣硬化（AS）形成中的炎癥機(jī)制、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制和研究姜黃素在保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞機(jī)制中的抗炎作用。
　　方法：
　　1.體外培養(yǎng)HUVEC。
　　2.MTT法檢測(cè)姜黃素的半數(shù)抑制濃度(IC50值)。通過(guò)MTT法，從0μmol/L、0.1μmol/L、0.5μmol/L

2、、1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L八個(gè)濃度中篩選出HUVEC對(duì)姜黃素的最大耐受藥物濃度。
　　3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同TNF-α藥物濃度和作用時(shí)間刺激HUVEC引起FKN的基因表達(dá)水平。分別檢測(cè)空白對(duì)照、TNF-α0.1ng/ml、TNF-α0.5ng/ml、TNF-α1.0ng/ml對(duì)HUVEC的FKNmRNA上調(diào)程度，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)培養(yǎng)16小時(shí)（h）后上述FKNm

3、RNA表達(dá)水平，依據(jù)結(jié)果選擇TNF-α0.5ng/ml進(jìn)行后續(xù)研究。用TNF-α0.5ng/ml的藥物濃度作用于HUVEC，分別比較藥物作用2h、4h、8h、12h、16h、24h后以及空白對(duì)照組相互之間FKNmRNA的不同表達(dá)程度。
　　4.Western-Blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同的姜黃素藥物濃度干預(yù)FKN基因和蛋白的表達(dá)效果。比較空白對(duì)照組、TNF-α0.5ng/ml+姜黃素0μmol/L組、TNF-α0.5ng/

4、ml+姜黃素2μmol/L組、TNF-α0.5ng/ml+姜黃素5μmol/L組、TNF-α0.5ng/ml+姜黃素10μmol/L組共5組刺激HUVEC，作用16h后使用熒光定量PCR法對(duì)HUVEC的FKNmRNA的不同表達(dá)程度進(jìn)行檢測(cè)；比較空白對(duì)照組、TNF-α0.5ng/ml+姜黃素0μmol/L組、TNF-α0.5ng/ml+姜黃素2μmol/L組、TNF-α0.5ng/ml+姜黃素5μmol/L組共4組刺激HUVEC，作用16

5、h后，使用Western-blot法比較各組間FKN的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中HUVEC生長(zhǎng)狀態(tài)良好，呈現(xiàn)典型的鋪路石狀排列，生物學(xué)性狀穩(wěn)定。
　　2.MTT法篩選出藥物姜黃素對(duì)HUVEC的抑制率約為5％時(shí)的藥物濃度為2～5μmol/L，是最佳藥物濃度。
　　3.TNF-α0.5ng/ml和1.0ng/ml均比Blank組能明顯地提高FKN的mRNA表達(dá)量的變化倍數(shù)；TNF-α0.5ng/m

6、l比TNF-α0.1ng/ml組能明顯地提高FKN的mRNA表達(dá)量的變化倍數(shù)。不同時(shí)間段（2h、4h、8h、12h、16h、24h）TNF-α0.5ng/ml刺激HUVEC，與Blank組比較，16h時(shí)FKN的mRNA表達(dá)量變化倍數(shù)顯著增加。
　　4. TNF-α0.5ng/ml+姜黃素0μmol/L組作用細(xì)胞16h后， FKNmRNA表達(dá)量變化倍數(shù)比Blank組明顯增多；與TNF-α0.5ng/ml+姜黃素0μmol/L組比較，

7、TNF-α0.5ng m/L+姜黃素2μmol/L組、TNF-α0.5ng/mL+姜黃素5μmol/L組、TNF-α0.5ng/mL+姜黃素10μmol/L組刺激HUVEC后其FKNmRNA表達(dá)量變化倍數(shù)均明顯下降；TNF-α0.5ng/mL+姜黃素2μmol/L組、TNF-α0.5ng/mL+姜黃素5μmol/L組、TNF-α0.5ng/mL+姜黃素10μmol/L組，刺激HUVEC后其FKNmRNA表達(dá)量變化倍數(shù)無(wú)顯著性差異。Bla

8、nk組、0.5ng/mL TNF-α+0μmol/L姜黃素組、0.5ng/mLTNF-α+2μmol/L姜黃素組、0.5ng/mL TNF-α+5μmol/L姜黃素組刺激HUVEC16h后，Western-Blot檢測(cè)FKN蛋白表達(dá)的變化：0.5ng/mL TNF-α+0μmol/L姜黃素組顯影最深，而B(niǎo)lank組、0.5ng/mL TNF-α+2μmol/L姜黃素組、0.5ng/mL TNF-α+5μmol/L姜黃素組均顯色較淡。