JNK通路介導LPS誘導臍靜脈內(nèi)皮細胞PD-L1表達的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┮呀?jīng)成為威脅人類健康的三大殺手之一，也是影響人們生活質(zhì)量的最常見、嚴重的心血管疾病之一。研究表明，動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病，在動脈粥樣斑塊內(nèi)有大量的巨噬細胞、單核細胞、T淋巴細胞和樹突狀細胞等炎癥細胞的浸潤，斑塊內(nèi)炎癥反應非常明顯;在冠心病的發(fā)生發(fā)展過程中，不論是從脂質(zhì)條紋到粥樣斑塊或纖維斑塊，還是不穩(wěn)定斑塊的生成、破裂、血栓形成，始終都有各種炎癥細胞的參與。由此可見，抑制

2、炎癥細胞活性，通過免疫調(diào)節(jié)阻斷炎癥反應通路已成為研究及治療冠心病的熱點和難點。眾所周知，炎癥反應的活化與T淋巴細胞明顯相關，而近年研究表明，負性刺激信號（PD-1/PD-L1）對T淋巴細胞活化起重要作用。
　　 JNK又稱c-Jun N-末端激酶或者應激活化的蛋白激酶(stress activiatedprotein kinase，SAPK)，是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase

3、，MAPK)超家族成員之一，是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，位于細胞胞質(zhì)之中，相對分子量為46×103和54×103，存在特定的功能區(qū)(Thr-Pro-Tyr)，其編碼基因為JNK1、JNK2和JNK3，其中JNK1和JNK2存在于全身各組織中，而JNK3主要存在于腦、心臟和睪丸等組織。JNK的活化是通過氨基末端殘基磷酸化實現(xiàn)的，而JNK的激活可以受多種細胞外因素的刺激而啟動，包括生長因子、細胞因子（IFN-γ、IL-1、TNF-α等）、應激

4、刺激（紫外線、細胞高滲透壓、缺血再灌注損傷）等。一旦JNK激活，JNK將由細胞質(zhì)轉入細胞核中，廣泛參與細胞凋亡、增殖、代謝及DNA損傷修復等多種生物學反應，而其功能的失調(diào)可造成神經(jīng)退行性病變、缺血再灌注損傷、糖尿病和腫瘤等多種疾病。
　　 程序性死亡因子配體1（programmed cell death ligand1，B7-H1、CD274或PD-L1）是由290個氨基酸構成的Ⅰ型跨膜蛋白。PD-L1是B7家族分子的重要成員，

5、它的受體既不是CTLA-4蛋白（cytotoxic T-lymphocyte Antigen4，CTLA-4），也不是ICOS蛋白（inducible co-stimulator，ICOS）和CD28蛋白，其受體為程序性死亡因子1（programmed cell death1 receptor，CD279或PD-1）。在最初的研究中發(fā)現(xiàn)，PD-L1在腫瘤細胞中有高表達，因此，人們推測PD-L1可能與腫瘤細胞浸潤有關;但近年研究表明，除腫

6、瘤細胞以外，PD-L1在許多炎癥細胞上均有表達，如T淋巴細胞、B淋巴細胞、Kupffer細胞、巨噬細胞、星形細胞、血管內(nèi)皮細胞、樹突狀細胞、胎盤合體滋養(yǎng)層細胞等等;PD-L1的功能除與腫瘤細胞浸潤明顯相關以外，還與多種疾病發(fā)生有密切的關系，如移植免疫反應、微生物感染（病毒感染）、自身免疫性疾病，近年來研究還發(fā)現(xiàn)與動脈粥樣斑塊形成也明顯有關。Gotsman等用熒光免疫技術研究冠狀動脈時發(fā)現(xiàn)，PD-L1表達于多處動脈粥樣斑塊內(nèi)。Lee等研究

7、也發(fā)現(xiàn)，冠心病患者較正常人相比，T淋巴細胞及樹突狀細胞PD-1/PD-L1表達均顯著降低，而T淋巴細胞增殖能力卻增強，證實PD-L1/PD-1與致動脈粥樣硬化性T淋巴細胞免疫調(diào)節(jié)有著密切聯(lián)系，能夠負性信號調(diào)控冠狀動脈粥樣斑塊形成，在冠心病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。雖然現(xiàn)在對PD-L1的功能有了一定了解，但對于PD-1/PD-L1細胞內(nèi)信號通路的轉導機制目前尚不明了。不同研究對象及使用不同刺激物所得出結果不完全相同，總的來說，影響PD-

8、L1表達的細胞信號通路可能為PI3K/Akt信號通路、JAK/STAT信號通路、NPM/ALK通路、MEK/Erk信號通路，以及與STAT-3和IRF-1轉錄因子有關。眾所周知，JNK信號通路是MAPK通路的重要分支，它能通過細胞外刺激誘導多種細胞凋亡的發(fā)生。然而關于PD-L1蛋白表達與JNK信號通路的關系的研究資料甚少。
　　 鑒于以上證據(jù)，本課題以體外培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細胞作為研究對象，利用炎癥因子(LPS)刺激臍靜脈內(nèi)皮細胞模

9、擬病原微生物入侵的模型，觀察臍靜脈內(nèi)皮細胞PD-L1表型的變化;再以JNK蛋白特異性抑制劑SP600125阻斷JNK通路，探討臍靜脈內(nèi)皮細胞表達PD-L1與JNK信號通路的關系，闡明LPS誘導臍靜脈內(nèi)皮細胞表達PD-L1蛋白的分子機制，完善負性協(xié)同刺激信號（PD-1/PD-L）調(diào)控T淋巴細胞活性的機理，有望為動脈粥樣硬化的免疫治療的提供新的思路及理論基礎。
　　 目的：
　　 1.LPS能否誘導臍靜脈內(nèi)皮細胞表達PD-L

10、1。
　　 2.以JNK蛋白特異性抑制劑SP600125阻斷JNK信號通路后，觀察樹突狀細胞受炎癥因子刺激后PD-L1表型變化，探討樹突狀細胞表達PD-L1與JNK信號通路的關系。
　　 對象和方法：
　　 1.對象
　　 體外培人臍靜脈內(nèi)皮細胞。
　　 2.方法
　　 2.1 臍靜脈內(nèi)皮細胞的分離、鑒定及傳代培養(yǎng)無菌條件下，取健康產(chǎn)婦剖腹產(chǎn)后新鮮的胎兒臍帶，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)緩沖液

11、清洗，用Ⅰ型膠原酶消化、離心，加入含20％胎牛血清的M199培養(yǎng)液，放入5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)中37℃培養(yǎng)。24h后換液，待細胞生長達鋪滿瓶底80％-90％，以0.125％胰蛋白酶消化后傳代培養(yǎng)，并在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)，選擇生長良好的第4～5代細胞用于實驗。采用形態(tài)學和內(nèi)皮細胞Ⅷ相關抗原進行鑒定。
　　 原代的細胞一般培養(yǎng)4-5天后細胞可長滿培養(yǎng)瓶底95％以上，顯微鏡下觀察細胞融合成單層呈鋪路石狀，此時可傳代。棄去培養(yǎng)瓶中舊

12、培養(yǎng)液，用PBS（37℃預熱20分鐘）洗滌2-3次，加入1ml0.125％的胰蛋白酶（37℃預熱20分鐘）室溫消化細胞20s，顯微鏡下觀察細胞皺縮變圓、彼此分離即可將胰蛋白酶吸出，然后加入M199完全培養(yǎng)液終止消化，吸管輕柔吹打至均勻細胞懸液，按1∶2傳代培養(yǎng)。
　　 2.2 程序降溫法凍存內(nèi)皮細胞，快速融化法復蘇細胞
　　 2.2.1 內(nèi)皮細胞的凍存用一次性吸管吸去培養(yǎng)瓶中廢棄的培養(yǎng)液，再用PBS洗滌細胞2次。以0.1

13、25％胰酶消化20秒，顯微鏡下觀察細胞變圓、皺縮。用一次性吸管吸出胰酶，凍存液加入培養(yǎng)瓶中終止消化。彎頭吸管吹打瓶中細胞數(shù)分鐘，顯微鏡下觀察細胞全部脫落。再將細胞懸液加入凍存管中，標記日期、細胞種類，封口膠封口。
　　 細胞程序降溫:4℃冰箱20分鐘→-20℃冰箱1小時→-70℃冰箱過夜→次晨投入液氮罐。
　　 2.2.2 內(nèi)皮細胞的復蘇用鑷子從液氮罐中取出標記內(nèi)皮細胞的凍存管，將其迅速放入37℃水浴箱中充分搖晃至凍存管

14、中細胞完全解凍（大約1分鐘）。用酒精擦拭凍存管后入超凈工作臺。在15ml離心管中預先加入3倍凍存細胞體積的M199完全培養(yǎng)基，用一次性吸管將細胞液吸出加入離心管中混勻。低速離心:300rpm離心5分鐘或500rpm離心3分鐘。去上清，加培養(yǎng)液培養(yǎng)。將培養(yǎng)瓶置入孵箱中培養(yǎng)，待細胞長滿后進行傳代。
　　 2.3 實驗分組（每組設3個復孔，重復實驗4次）
　　 收獲第五代臍靜脈內(nèi)皮細胞，調(diào)整細胞密度為2×107/ml，接種于6

15、孔培養(yǎng)板中。根據(jù)是否使用LPS和JNK蛋白特異性抑制劑SP600125將實驗分成三組:陰性對照組、LPS組和SP600125+LPS組(LPS及SB203580均用二甲基亞砜(DMSO)溶解）
　　 第一組為陰性對照組(NORMAL):將未加入任何藥物的細胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時作為陰性對照。
　　 第二組為LPS刺激組(LPS):首先在實驗細胞中加入DMSO(0.1％V/V)作用1小時，再加入LPS(1.0μg/ml)繼續(xù)培

16、養(yǎng)24小時(LPS每12 h半量換液);
　　 第三組為SP600125+LPS共刺激組:首先在實驗細胞中加入SP600125(20μmol/L)作用1h后再用LPS刺激24 h(LPS每12 h半量換液)。
　　 2.4 Western blot檢測PD-L1蛋白自6孔培養(yǎng)板中提取人臍靜脈內(nèi)皮細胞，用RIPA細胞裂解液抽提全細胞蛋白樣品，并經(jīng)BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉移到PVDF膜上，5％

17、的脫脂奶粉封閉2h，加入抗PD-L1多克隆抗體，4℃孵育過夜，PBS洗膜后加入二抗，37℃孵育2h后ECL發(fā)光，暗室中曝光、顯影、定影。QuantityOne凝膠軟件分析系統(tǒng)分析蛋白條帶的光密度值。
　　 2.5 Western blot檢測 P-JNK、JNK蛋白自6孔培養(yǎng)板中提取人臍靜脈內(nèi)皮細胞，用RIPA細胞裂解液抽提全細胞蛋白樣品，并經(jīng)BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉移到PVDF膜上，5％的脫脂奶

18、粉封閉2h，加入抗p-JNK多克隆抗體和抗JNK多克隆抗體，4℃孵育過夜，PBS洗膜后加入二抗，37℃孵育2h后ECL發(fā)光，暗室中曝光、顯影、定影。Quantity One凝膠軟件分析系統(tǒng)分析蛋白條帶的光密度值，以p-JNK/JNK蛋白光密度的比值代表p-JNK的光密度值，分別算出陰性對照組、LPS組、SP600125+LPS組光密度的比值。
　　 3.統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件處理，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差((x

19、)±S)表示，統(tǒng)計學分析多樣本比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多重比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 4.結果
　　 4.1 MTT檢測HUVECs增殖各組臍靜脈內(nèi)皮細胞OD值測定。陰性對照組OD值為0.32±0.003，LPS組OD值為0.34±0.033，SP600125+LPS組OD值為0.31±0.018，各組OD值比較P＞0.05，各組細胞增殖無顯著差異。

20、r>　　 4.2 Western blot檢測 PD-L1蛋白Western blot曝光灰度掃描結果（Z值）顯示，LPS組為1.12±0.72，SP600125+LPS組為0.66±0.36，對照組為0.59±0.30。SP600125+LPS組與對照組Z值均小于LPS組（P＜0.05或P＜0.05)，SP600125+LPS組Z值與陰性對照組無顯著差異(P＞0.05)。
　　 4.3 Western blot檢測JNK、P

21、-JNK蛋白Western blot曝光灰度掃描結果（Z值）顯示，LPS組為1.26±0.09，SP600125+LPS組為0.49±0.18，對照組為0.95±0.21。SP600125+LPS組Z值均小于其它2組（P＜0.05或P＜0.05)，LPS組Z值顯著大于對照組(P＜0.05)。
　　 結論：
　　 1.LPS可以誘導臍靜脈內(nèi)皮細胞PD-L1表達增高;
　　 2.JNK信號通路可能參與調(diào)控臍靜脈內(nèi)皮細