錳誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及其機(jī)理研究.pdf

1、本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC-304細(xì)胞)為靶細(xì)胞，通過(guò)體外試驗(yàn)來(lái)探討氯化錳對(duì)其凋亡的誘導(dǎo)作用及其分子機(jī)制。 方法： 以不同濃度(100-800umol/L)的氯化錳分別處理HuVEC-304細(xì)胞，采用MTT法檢測(cè)HUEVC.304細(xì)胞的生長(zhǎng)活性；瓊脂糖凝膠電泳和流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈擴(kuò)增(RT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞p21WAF1/CIP1的mRNA表達(dá)，免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞P53蛋白表達(dá)

2、，蛋白印跡法(Western blot)檢測(cè)HUVEC-304細(xì)胞caspase3、caspase9、P53、p21WAF1/CIP1細(xì)胞蛋白含量。 結(jié)果： MTT法結(jié)果顯示錳對(duì)HUVEC-304細(xì)胞生長(zhǎng)抑制呈時(shí)間劑量依賴性，錳染毒培養(yǎng)24h、48h、78h后，HUVEC-304細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為100μmol/L(22.34±8.22)％、(27.47±8.51)％、(38.07±9.86)％；200μmol/L(3

3、3.62±9.69)％、(42.56±0.95)％、(59.35±2.36)％；400μmol/L(55.03±6.20)％、(62.12±1.95)％、(69.60±3.77)％；800μmol/L(76.06±1.51)％、(81.29±1.54)％、(90.94±1.28)％。各組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)性意義(P<0.05)，24h IC<,50>為400μmol/L。 流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示氯化錳能誘導(dǎo)HUVEC-304細(xì)胞凋亡，10

4、0μmol.L、200μmol/L、400μmol/L、800btmol/L Mncl<,2>誘導(dǎo)HUVEC.304細(xì)胞凋亡率分別為(10.20±0.03)％、(27.36±0.02)％、(62.00±0.01)％、(98.73±0.04)％(P<0.05)。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示200、400umol/L的氯化錳組可以看到明顯的細(xì)胞凋亡梯形條帶，說(shuō)明氯化錳能夠誘導(dǎo)HUVEC-304細(xì)胞的凋亡。 免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞P53蛋白

5、的表達(dá)，結(jié)果顯示氯化錳作用24h后細(xì)胞P53的表達(dá)是逐漸降低的，低劑量100pmol/L組P53蛋白表達(dá)跟對(duì)照比較差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，200μmol/L、400μmol/L組跟對(duì)照比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 HUVEC-304細(xì)胞經(jīng)不同濃度氯化錳100umol/L、200umol/L、400umol/L和800pmol/L處理24h后，RT-PCR檢測(cè)p21WAF1/CIP1的mRNA表達(dá)，p21WAF1/CIP1m

6、RNA表達(dá)隨著氯化錳的濃度增高而升高(P<0.05)。說(shuō)明氯化錳能夠上調(diào)HUVEC-304細(xì)胞p21WAF1/CIP1mRNA的表達(dá)并呈濃度依賴性。 Wstern blot蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，濃度400umol/L氯化錳染毒培養(yǎng)HUVEC-304細(xì)胞24h后，caspase9和caspase3蛋白含量均明顯升高，吸光度值(A值)分別為(488.03±2.16)、(476.31±2.05)，與對(duì)照組相比90.13±1.61差異

7、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。不同濃度為100 umol/L、200 umol/L、400 umol/L和800umol/L氯化錳染毒培養(yǎng)HUVEC-30細(xì)胞24h后，P53蛋白含量隨氯化錳濃度增高而降低，并呈濃度依賴性。A值分別為(521.25±3.16)、(315.76±1.83)、(273.02±1.95)、(163.42±2.05)，與對(duì)照組相比(693.37±2.13)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。p21WAF1/CIP1

8、蛋白含量隨氯化錳濃度增高而增強(qiáng)，并呈濃度依賴性。A值分別為(19.654±0.316)、(33.759±0.183)、(54.085+0.195)、(68.164±0.205)，與對(duì)照組相比(15.901±0.213)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論：氯化錳能顯著抑制HUVEC-304細(xì)胞的增殖并且誘導(dǎo)其凋亡。氯化錳使HUVEC-304細(xì)胞p21WAF1/CIP1轉(zhuǎn)錄活性增加和蛋白表達(dá)上調(diào)，caspase9、caspas