過敏性紫癜血清IgA1誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的體外實驗研究.pdf

1、目的：
　　通過觀察HSP患兒血清IgA1和正常兒童血清IgA1對體外培養(yǎng)的HUVECs凋亡誘導(dǎo)作用,及其對P53、Bax、Bcl-2和Caspase-3表達(dá)的影響,探討IgA1誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的分子機制,為明確IgA1在HSP血管損傷中的作用提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.血清采集及IgA1的分離提取2010年9月-2011年1月在本院兒科住院明確診斷HSP的初發(fā)患兒10例,10名與HSP患兒同時期、同地區(qū)無風(fēng)濕

2、免疫性疾病史的門診健康體檢兒童作為正常對照。所有受試患兒清晨空腹采取外周靜脈非抗凝全血5ml,分離血清。親和層析法分離提取血清IgA1。
　　2.實驗分組用含10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640常規(guī)培養(yǎng)HUVECs,依據(jù)培養(yǎng)條件不同分為3組:①HSP組:用含不同濃度(0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.25mg/ml)HSP患兒血清IgA1的RPMI-l640培養(yǎng);②正常對照組:用含不同濃度(0.05mg/ml、0.

3、1mg/ml、0.25mg/ml)正常兒童血清IgA1的RPMI-l640培養(yǎng);③空白對照組:用不含IgA1的RPMI-l640培養(yǎng)。
　　3.細(xì)胞凋亡的觀察與檢測光學(xué)顯微鏡下觀察IgA1誘導(dǎo)前后各組HUVECs形態(tài)學(xué)變化;各組于誘導(dǎo)因素加入后12h和24h分別收集一次細(xì)胞,行流式細(xì)胞儀(FCM)和TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡率。
　　4.凋亡相關(guān)基因檢測0.25mg/mlIgA1誘導(dǎo)HUVECs24h時應(yīng)用實時熒光定量聚合酶鏈

4、反應(yīng)(Real time PCR)和蛋白質(zhì)印記技術(shù)(Western blot)檢測各組HUVECs中凋亡相關(guān)基因P53、Bax、Bcl-2及Caspase-3 mRNA及蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.光學(xué)顯微鏡下觀察可見IgA1誘導(dǎo)24h時HUVECs圓縮,體積縮小,與周圍細(xì)胞脫離,HSP組較正常對照組改變更加明顯。
　　2.各組HUVECs誘導(dǎo)培養(yǎng)12h時,HSP組和正常對照組FCM法IgA1為0.25mg/m

5、l,TUNEL法IgA1為0.1mg/ml時,即可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡(P<0.01),但HSP組與正常對照組比較差異無顯著性(P>0.05)。在誘導(dǎo)培養(yǎng)24h時,HSP組和正常對照組IgA1為0.1 mg/ml時即可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡(P<0.01),HSP組凋亡率與正常對照組相比顯著增加(P<0.01),且隨著IgA1濃度增加及誘導(dǎo)時間延長,細(xì)胞凋亡率逐漸增加(P<0.01)。
　　3.0.25mg/ml IgA1誘

6、導(dǎo)24h時,HSP組和正常對照組與空白對照組相比, P53、Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)均明顯增多,Bcl-2 mRNA表達(dá)均明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);HSP組P53、Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)的增加和Bcl-2 mRNA表達(dá)的減少較正常對照組變化更為顯著(P<0.05)。
　　4.0.25mg/ml IgA1誘導(dǎo)各組HUVECs24h時,HSP組和正常對照組與空白對照組相比,P53、B

7、ax、Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增多,Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減少(P<0.01);HSP組與正常對照組相比也有顯著性差異(P<0.01)。
　　結(jié)論：
　　1.IgA1可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)HUVECs凋亡,HUVECs凋亡率與IgA1的劑量和作用時間具有一定的量效時效關(guān)系,當(dāng)作用時間及IgA1濃度相同時,HSP患兒血清提取的IgA1對HUVECs的凋亡誘導(dǎo)作用更強。
　　2.IgA1誘導(dǎo)體外培養(yǎng)HUVECs凋亡的機制可