ATF3在LPS誘導的急性肺損傷炎癥中的作用及機制研究.pdf

1、1.背景和目的
　　急性肺損傷（ALI），急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是因為各種肺內(nèi)、外因素所致的以肺泡毛細血管膜彌漫性損傷、嚴重低氧血癥為特征的呼吸危重癥，因外其發(fā)病機制尚不完全清楚，所以仍有較高的病死率。其中，炎癥反應(yīng)失衡在疾病的發(fā)生發(fā)展中占有重要地位。
　　由革蘭陰性桿菌感染引起的膿毒血癥是導致 ALI/ARDS的重要病因，而脂多糖（LPS）作為革蘭陰性桿菌的胞壁成分是先天性免疫反應(yīng)及炎癥反應(yīng)的啟動子，是導致 ALI

2、/ARDS的重要原因之一。因此，明確 LPS導致炎癥損傷的發(fā)病機制對急性肺損傷的治療有重要意義。目前已證實，轉(zhuǎn)錄活化因子3（ATF3）是一應(yīng)激早期快反應(yīng)基因，其表達與炎癥反應(yīng)、機體穩(wěn)態(tài)維持、腫瘤發(fā)生等密切相關(guān)。在多種炎癥模型中，ATF3對炎癥反應(yīng)起剎車作用。然而， ATF3在LPS致急性肺損傷中的作用尚不完全清楚。鑒于此，本課題擬通過比較腹腔注射LPS后的野生型小鼠和ATF3敲基因小鼠的各項炎癥指標，明確ATF3在LPS致急性肺損傷小鼠

3、模型中的作用；將兩組小鼠肺組織通過基因芯片技術(shù)尋找其差異基因；并最后通過構(gòu)建干擾質(zhì)粒下調(diào)ATF3在小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7細胞中的表達，探討ATF3調(diào)控LPS導致炎癥反應(yīng)的可能機制，從而為急性肺損傷的防治提供潛在的新靶點。
　　2.研究方法
　?。?）構(gòu)建急性肺損傷動物模型，并明確ATF3在動物模型中的表達規(guī)律。向小鼠進行腹腔注射LPS，注射量為15mg/kg，從而建立急性肺損傷小鼠的動物模型，分別采取RT-PCR

4、以及Western blot的方法，檢測ATF3在LPS刺激后的各個時相點，小鼠肺組織中的表達情況，從而明確其表達規(guī)律。
　?。?）觀察ATF3對LPS誘導的急性肺損傷小鼠的保護作用。構(gòu)建ATF3敲基因小鼠，用Western blot的方法鑒定敲基因小鼠中ATF3的表達缺失，通過比較野生型小鼠和ATF3敲基因小鼠的肺組織病理切片、肺組織濕干比、肺組織中炎癥因子的表達水平、肺泡灌洗液蛋白濃度以及7天存活率來評估ATF3對LPS誘導的

5、急性肺損傷小鼠的保護作用。
　?。?）利用基因芯片技術(shù)篩選急性肺損傷小鼠中與ATF3相關(guān)的差異基因。同時用LPS對C57小鼠及ATF3敲基因小鼠進行腹腔注射后2小時，然后提取兩組小鼠肺組織的總 RNA，通過基因芯片技術(shù)篩選差異表達基因。再結(jié)合文獻閱讀，最終重點關(guān)注TL1A分子，并提出ATF3可能是通過下調(diào)TL1A的表達實現(xiàn)對急性肺損傷的炎癥保護作用這一假說。
　?。?）以小鼠單核巨噬細胞株RAW264.7細胞為模型探討ATF

6、3在LPS誘導的急性肺損傷中的可能機制。用RT-PCR和Western blot的方法比較RAW264.7細胞中，ATF3在LPS刺激后各個時間點的表達變化。構(gòu)建質(zhì)粒，用RNA干擾的方法下調(diào)ATF3在RAW264.7細胞中的表達，觀察ATF3對LPS誘導的細胞炎癥損傷以及信號分子通路TL1A表達的影響；采用siRNA雙干擾技術(shù)同時下調(diào)ATF3和TL1A在RAW264.7細胞中的表達后，通過檢測炎癥因子IL-6的表達變化說明TL1A信號通

7、過在ATF3調(diào)控LPS誘導的急性肺損傷中的作用。
　　3.結(jié)果
　?。?）ATF3表達于正常小鼠肺組織，LPS腹腔注射后，小鼠肺組織內(nèi)ATF3的表達水平明顯增加，以LPS腹腔注射2h時相點達表達高峰，RT-PCR與Western blot的結(jié)果趨勢一致。
　?。?）將野生型小鼠與ATF3敲基因小鼠作為對比，LPS腹腔注射以后，ATF3敲基因小鼠的肺組織病理損傷加重，肺組織濕干比增加，炎癥因子 IL-6、IL-1β、TN

8、F-α表達增加，肺泡灌洗液蛋白濃度增加，小鼠7天存活率顯著下降。
　?。?）從基因芯片的結(jié)果中找到了ATF3敲基因小鼠和野生型小鼠的差異基因TL1A，結(jié)合閱讀文獻，提出了ATF3可能通過下調(diào)TL1A表達，對LPS誘導的急性肺損傷炎癥起到調(diào)控作用的科學假說。
　?。?）LPS刺激后，ATF3在RAW264.7細胞中的表達上調(diào)，表達高峰點在LPS處理6h后，下調(diào)ATF3的表達會增加LPS誘導的炎癥因子TNF-α和IL-6的釋放；

9、與LPS和NCsiRNA+LPS組相比，ATF3siRNA組和ATF3siRNA+LPS組RAW264.7細胞中TL1A的表達顯著增加，為進一步證實TL1A信號通路在ATF3調(diào)控LPS誘導的急性肺損傷中的作用，同時下調(diào)了 ATF3和 TL1A在 RAW264.7細胞中的表達，與ATF3siRNA+LPS組相比，ATF3siRNA+TL1AsiRNA組RAW264.7細胞中IL-6的表達顯著降低。
　　4.結(jié)論
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