SPLUNC1在LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目前認(rèn)為慢性炎癥是20-25％的惡性腫瘤發(fā)生的主要驅(qū)動(dòng)者，炎-癌分子機(jī)制的探討已成為癌變?cè)硌芯款I(lǐng)域關(guān)注的重要焦點(diǎn)。革蘭氏陰性菌是與鼻咽部長(zhǎng)期共存的主要病原微生物，是致鼻咽部慢性炎癥的常見因素。如果病原微生物長(zhǎng)期持續(xù)刺激鼻炎上皮則會(huì)導(dǎo)致鼻咽局部形成慢性炎癥。眾所周知，細(xì)菌內(nèi)毒素即脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性菌主要毒力因素，它可作用于細(xì)胞膜受體CD14和TLR4，從而發(fā)揮生物學(xué)作用。
　　SPL

2、UNC1基因作為鼻咽及上呼吸道上皮細(xì)胞編碼一種分泌性蛋白，是細(xì)胞的固有免疫分子。前期研究發(fā)現(xiàn)SPLUNC1含有一個(gè)BPI結(jié)構(gòu)域，BPI能與革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁上的LPS特異性地結(jié)合。重組的SPLUNC1蛋白能經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌到培養(yǎng)上清液中并具有結(jié)合細(xì)菌脂多糖，以及殺滅或抑制上呼吸道綠膿桿菌的功能。SPLUNC1在預(yù)防病原微生物感染和抑制過(guò)度炎癥反應(yīng)方面起到重要作用。
　　本課題將在構(gòu)建SPLUNC1基因封閉與基因剔除的細(xì)胞和動(dòng)物模型

3、基礎(chǔ)上，深入研究LPS誘導(dǎo)的TLR4/NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中SPLUNC1預(yù)防或阻斷炎-癌反應(yīng)過(guò)程的可能的作用和分子機(jī)制，并為鼻咽癌分子診治提供新靶點(diǎn)及新線索。
　　LPS可通過(guò)TLR4/NF-κB信號(hào)通路引起鼻咽癌細(xì)胞促炎因子的分泌和鼻咽癌細(xì)胞的增殖
　　慢性感染的重要毒力因素被認(rèn)為是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分LPS，對(duì)LPS的識(shí)別與信號(hào)傳導(dǎo)是宿主細(xì)胞抵御革蘭氏陰性細(xì)菌的關(guān)鍵。同時(shí)LPS及其介導(dǎo)的TLR4信

4、號(hào)傳導(dǎo)途徑被認(rèn)為是慢性感染導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要的因素。為了研究LPS引起的慢性炎癥對(duì)鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的影響，本研究采用合適濃度的LPS(1ug/ml)作用于鼻咽癌細(xì)胞系5-8F和6-10細(xì)胞系。流式細(xì)胞周期分析和MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS能夠促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞系細(xì)胞周期進(jìn)程進(jìn)而引起細(xì)胞增殖。同時(shí)LPS刺激24小時(shí)后，Real-time PCR和ELISA檢測(cè)促炎因子IL-6，IL-8，TNF-α和IL-1β的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，LPS能夠促進(jìn)促炎因子的分泌

5、。LPS是TLR4的配體之一。為了瞭解LPS是否通過(guò)TLR4信號(hào)通路影響鼻咽癌細(xì)胞促炎因子的分泌和細(xì)胞增殖，本研究采用Western-blot和Real-time PCR檢測(cè)了TLR4信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS能顯著提高CD14，TLR4，MyD88，p-p65表達(dá)以促進(jìn)促炎因子的分泌。采用免疫熒光技術(shù)和熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在LPS誘導(dǎo)下，鼻咽癌細(xì)胞中NF-KB(p65)被活化進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。NF/κB(p65)持續(xù)

6、活化是慢性炎癥發(fā)生的主要因素。因此本文認(rèn)為:在鼻咽癌細(xì)胞中，LPS通過(guò)TLR4-MyD88-NF-κB(p65)信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)NF-κB(p65)的活化入核，導(dǎo)致促炎因子的大量分泌進(jìn)而導(dǎo)致炎癥的持續(xù)發(fā)生和細(xì)胞增殖。
　　SPLUNC1與TLR4在正常和鼻咽癌患者組織中的動(dòng)態(tài)表達(dá)
　　前期的研究發(fā)現(xiàn)SPLUNC1在正常鼻咽組織中高表達(dá)，而在鼻咽癌患者組織中低表達(dá)或者不表達(dá);腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的TLR4能促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸從而促進(jìn)

7、腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究利用鼻咽癌組織芯片采用免疫組化法觀察了SPLUNC1與TLR4在正常鼻咽組織和鼻咽癌組織中的表達(dá)情況，并分析了兩者表達(dá)的相關(guān)性以及對(duì)鼻咽癌患者的預(yù)后判斷。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正常鼻咽組織中SPLUNC1的高表達(dá)，而炎癥組織中SPLUNC1的表達(dá)減弱，鼻咽癌組織中SPLUNC1的表達(dá)逐漸消失;但是TLR4在正常鼻咽組織中呈弱表達(dá)，炎癥組織中TLR4表達(dá)升高，且在鼻咽癌組織中呈高表達(dá)。相關(guān)性分析得出SPLUNC1與TLR4的表達(dá)

8、呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。Kaplan-Meier生存分析顯示SPLUNC1表達(dá)越低，TLR4表達(dá)越高，鼻咽癌患者預(yù)后越差。
　　SPLUNC1通過(guò)TLR4/NF-κB信號(hào)通路抑制LPS引起的促炎因子的分泌和細(xì)胞增殖
　　為了篩選合適的細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，本研究對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系進(jìn)行了SPLUNC1和TLR4的表達(dá)篩選，Real-time PCR和WB觀察發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細(xì)胞系5-8F和正常鼻咽上皮細(xì)胞系NP-69較合適進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。SPLUNC

9、1含有BPI結(jié)構(gòu)域，能夠與細(xì)菌LPS結(jié)合，為了證實(shí)SPLUNC1是制約LPS引起的細(xì)胞增殖和促炎因子分泌的關(guān)鍵因素的設(shè)想，本研究構(gòu)建了穩(wěn)定高表達(dá)SPLUNC1的5-8F細(xì)胞系和穩(wěn)定干擾SPLUNC1的NP69細(xì)胞系，并使用LPS(1ug/ml)刺激5-8F/ctrl和5-8F/SPLUNC1細(xì)胞系以及NP-69/Ctrl和NP69/SPLUNC1 si細(xì)胞系。通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SPLUNC1的5-8F細(xì)胞系明顯比空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞系

10、增殖慢，同時(shí)干擾SPLUNC1的NP69細(xì)胞系經(jīng)LPS刺激后增殖速度比對(duì)照組明顯加快。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)也表明SPLUNC1基因能夠阻止LPS引起的細(xì)胞增殖，導(dǎo)致鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)阻滯在G0/G1期。同時(shí)Real-time PCR和ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SPLUNC1基因能夠在mRNA水平和蛋白水平抑制LPS引起的促炎因子IL-6，IL-8，TNF-α和IL-1β的分泌。以上結(jié)果證實(shí)SPLUNC1能夠抑制LPS引起的促炎因子的分泌和鼻咽癌細(xì)胞

11、的增殖。因?yàn)長(zhǎng)PS可通過(guò)TLR4-MyD88-NF-κB(p65)信號(hào)通路促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞系促炎因子的分泌和細(xì)胞增殖，于是本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了SPLUNC1在這一過(guò)程中的作用。使用LPS（1ug/ml）刺激5-8F/ctrl和5-8F/SPLUNC1細(xì)胞系以及NP-69/Ctrl和NP69/SPLUNC1 si細(xì)胞系24小時(shí)后，收集蛋白進(jìn)行Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SPLUNC1能夠抑制LPS引起的TLR4、MyD88、p-p65(

12、NF-κB)表達(dá)的升高。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果和免疫熒光結(jié)果顯示，盡管受到LPS的刺激，SPLUNC1也能阻止NF-κB入核，同時(shí)也能抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性。
　　為了在體內(nèi)證實(shí)SPLUNC1抑制LPS引起的炎癥反應(yīng)的功能，本研究構(gòu)建了Splunc1基因敲除小鼠，取Splunc1敲除小鼠和野生型小鼠肺組織和MEF檢測(cè)Tlr4/Nf-κb通路關(guān)鍵分子的表達(dá)，并對(duì)Splunc1敲除小鼠和野生型小鼠進(jìn)行腹腔注射LPS(5mg/kg)

13、刺激24小時(shí)后，取小鼠肺組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，同時(shí)收集小鼠外周血進(jìn)行ELISA檢測(cè)。Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Splunc1敲除后，Splunc1敲除小鼠肺組織和MEF（Splunc1-/-）中Cd14，Tlr4、Myd88、p-p65(Nf-κb)表達(dá)的升高而Ikbα的表達(dá)降低。ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Splunc1敲除小鼠LPS刺激后，外周血中促炎因子Il-6，Il-8表達(dá)升高。
　　上述研究結(jié)果證明SPLUNC1基因可通過(guò)降