抑制STAT3信號通路活化對LPS誘導的ARDS炎癥反應保護作用的機制研究.pdf

1、急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的病理基礎(chǔ)是各種肺內(nèi)外原因（包括直接原因和間接原因）導致的肺泡-毛細血管通透性增加，進而引起肺不張及過度失控的肺部炎癥反應，導致急性、進行性加重的呼吸衰竭，其病死率可高達30％-60％。在ARDS的早期階段，單核-巨噬細胞系統(tǒng)被激活，釋放炎癥細胞因子如白介素-1β(interleukin-1，IL-1β)、IL-8、腫瘤壞死因子-α(t

2、umor necrosis factor-α，TNF-α)等，在這些炎癥細胞因子的作用下，中性粒細胞和內(nèi)皮細胞等被激活，進而引起肺組織中大量的炎癥細胞（包括中性粒細胞和巨噬細胞）浸潤及激活，啟動炎癥反應的級聯(lián)反應，而且可以使炎癥反應部位血管內(nèi)皮細胞黏附分子的表達增加，最終導致肺組織損傷。
　　JAK-STAT是近年來新發(fā)現(xiàn)的一條細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑。研究表明許多細胞因子(IFN、IL-2、IL-4、IL-6、CNTF等)和生長因子(

3、EGF、PDGF、CSF等)都利用該信號轉(zhuǎn)導途徑誘導細胞的增殖、分化或凋亡，它們在免疫功能調(diào)節(jié)、造血細胞生成、腫瘤發(fā)生及神經(jīng)和胚胎發(fā)育中發(fā)揮著既特異又有多效性的生物學功能。信號傳導蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物(signal transducers and activators of transcription3，STAT3)可通過介導炎癥介質(zhì)的細胞外信號調(diào)控免疫細胞的生物學行為，是炎癥形成過程中不可或缺的關(guān)鍵性分子。STAT3信號通路的激活可活化巨

4、噬細胞，進而促進炎性細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，加重ARDS的疾病進程。
　　STAT3的特異性抑制劑LLL12，是STA-21的衍生物?？商禺愋耘cSTAT3中的tyrosine705(Y705)結(jié)合，阻止STAT3信號通路活化及其下游的反應，進而可使細胞因子、粘附分子、趨化因子的表達減少，抑制中性粒細胞等炎性細胞在肺內(nèi)的聚集。
　　目的：
　　本研究探討在小鼠ARDS過程中，應用STAT3抑制劑LLL12和條件性敲除S

5、TAT3活化的負調(diào)節(jié)因子(SOCS3)后，觀察STAT3的活化程度，以及肺組織炎癥細胞浸潤及炎癥細胞因子表達的變化，以明確STAT3的激活在ARDS中的促炎作用，從而為治療ARDS提供新的思路和理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　動物模型的建立及分組
　　鼻內(nèi)滴入50 ul LPS(100mg/kg)建立C57BL/6小鼠、SOCS3fl/fl小鼠、LysMCre-SOCS3fl/fl小鼠ARDS模型，隨機分對照組(UN組)、

6、脂多糖組(LPS組)、LLL12干預組(LPS+LLL12組)。于鼻內(nèi)滴入LPS前2小時腹腔內(nèi)注射LLL12(5mg/kg)來實現(xiàn)對小鼠ARDS的干預。UN組腹腔內(nèi)注射20ml/kg的生理鹽水。
　　標本的采集:
　　每組小鼠于造模后24h、48h、72h及96h吸入異氟烷(100mg/Kg)麻醉。并采集血液和BALF，留肺組織行HE染色，檢測血液及BALF中炎癥細胞以及血清和BALF中細胞因子表達的變化。體外培養(yǎng)巨噬細胞，

7、分別給予LPS、LPS和LLL12刺激，檢測STAT3、STAT1、NF-κB以及ERK1/2的磷酸化程度同時檢測TNF-α、IL-1β和iNOS的表達情況。
　　檢測方法及指標:
　　1.HE染色評估肺組織病理損傷及評分，同時測定肺泡-動脈氧分壓差及肺濕干重比值(W/D)。
　　2.取BALF細胞沉渣，進行流式細胞學，計數(shù)單核白細胞總數(shù)及CD11b+CD45+和CD11b+/CD11c+的比例，同時檢測STAT3的磷

8、酸化程度。
　　3.收集BALF上清液及備用血清，ELISA法檢測TNF-α、IL-1β及CCL2的水平。
　　4.采用實時逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(Real-time RT-PCR)方法檢測巨噬細胞中細胞因子的表達。
　　5.采用Western Blot方法檢測巨噬細胞中STAT3信號通路的活化情況。
　　結(jié)果:
　　1.一般情況:
　　UN組小鼠呼吸平穩(wěn)，解剖后肺部外觀色澤粉紅;LPS組小鼠呼吸急促，

9、口唇發(fā)紺，解剖后肺體積增大，色澤暗紅或紫紅，臟層胸膜下點狀、片狀出血，與SOCS3fl/fl小鼠的一般情況相比，LysMCre-SOCSfl/fl小鼠的呼吸、進食、活動能力及肺組織的體積和出血情況均明顯加重;LPS+LLL12組小鼠均可見呼吸急促減輕，解剖后肺體積無明顯增大，色澤呈紅色，表面見少許散在的出血點，包膜張力減輕。
　　2.肺組織病理損傷及評分
　　2.1 HE染色:UN組肺組織結(jié)構(gòu)完整正常;LPS組部分肺泡壁不同

10、程度的破壞或斷裂，肺微血管充血、出血、微血栓形成，肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)見大量炎性細胞浸潤、Ⅰ型肺泡上皮細胞壞死，與SOCS3fl/fl小鼠肺組織病理變化比較，LysMCre-SOCS3fl/fl小鼠肺組織的上述病理變化在各時間點均明顯加重;LLL12干預后肺組織損傷程度減輕。
　　2.2 肺病理評分:
　　LPS組肺組織病理評分明顯高于UN組，LysMCre-SOCS3fl/fl小鼠病理評分明顯高于SOCS3fl/fl小鼠;LL

11、L12干預后病理評分較LPS組下降，病理評分與HE染色肺組織損傷的動態(tài)變化趨勢相似。
　　3.肺泡-動脈氧分壓差P(A-a)O2
　　各時相LPS組P(A-a)O2明顯高于UN組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，LysMCre-SOCS3fl/fl小鼠P(A-a)O2明顯高于SOCS3fl/fl/小鼠(P＜0.01)，LLL12干預后，隨著時間延長，肺組織氧合得到部分改善，與LPS組比較P(A-a)O2逐漸減少(P＜0.0

12、5)，但仍明顯高于UN組。
　　4.肺組織濕/干重比值(W/D)
　　LPS組肺組織W/D比值明顯高于UN組(P＜0.01)，LysMCre-SOCS3fl/fl小鼠W/D比值明顯高于SOCS3fl/fl小鼠(P＜0.01); LLL12干預后W/D比值較LPS組下降，與肺損傷病理評分的動態(tài)變化趨勢相似。
　　5.BALF中白細胞總數(shù)及CD11b+CD45+和CD11b+/CD11c+的比例:
　　LPS組白細胞

13、總數(shù)及CD11b+CD45+和CD11b+/CD11c+比例較UN組進行性增加;與LPS組對比，LLL12干預后白細胞總數(shù)及CD11b+CD45+和CD11b+/CD11c+比例下降。
　　6.血清及BALF中TNF-α、IL-1β及CCL2的表達
　　LPS組血清及BALF中TNF-α、IL-1β及CCL2的濃度明顯高于UN組，LysMCre-SOCS3fl/fl小鼠中各炎癥細胞因子的增加幅度更為顯著;LLL12干預后TN

14、F-α、IL-1β及CCL2的濃度在24h、48h、72h及96h均低于LPS組，而在48h明顯低于LPS組，差異有顯著意義(P＜0.01），但均高于UN組。
　　7.Western blot檢測巨噬細胞中STAT3的磷酸化水平
　　LPS刺激體外培養(yǎng)的巨噬細胞，STAT3的磷酸化水平增高，來源于LysMCre-SOCS3fl/fl小鼠的巨噬細胞中STAT3活化程度明顯增強;而應用LLL12抑制STAT3的磷酸化后，TNF-

15、α、IL-1β和iNOS的表達均降低。
　　結(jié)論：
　　1.LPS誘導的ARDS中，STAT3信號通路的激活，中性粒細胞和巨噬細胞在肺內(nèi)的聚集增加，細胞因子(TNF-α、IL-1β)及趨化因子(CCL2)表達增加。
　　2.LLL12通過抑制STAT3的激活，下調(diào)細胞因子及趨化因子的表達，減少中性粒細胞和巨噬細胞的聚集，肺組織損傷減輕，為ARDS的治療提供新的思路和理論基礎(chǔ)。
　　3.條件性敲除STAT3活化的負