自噬相關(guān)蛋白4B(Atg4B)在棉鈴蟲生長發(fā)育中的功能研究.pdf

1、研究背景、科學(xué)問題以及研究意義:
　　昆蟲(insect)種類繁盛，形態(tài)各異，是世界上種類和數(shù)量最多的動物類群。昆蟲幼蟲生長過程中伴隨著多次蛻皮(molting)，由幼蟲向蛹轉(zhuǎn)變過程則經(jīng)歷變態(tài)(metamorphosis)。蛻皮只是形態(tài)發(fā)生變化，變態(tài)則是其內(nèi)部組織發(fā)生組織重建，表現(xiàn)為典型的幼蟲專性組織如中腸、脂肪體、腹部節(jié)間肌肉、絲腺、唾液腺等發(fā)生組織降解，新的成蟲組織如成蟲中腸等形成。昆蟲變態(tài)發(fā)育時期組織重建主要是由程序性細(xì)胞死

2、亡(programmed cell death，PCD)來執(zhí)行的，并且受蛻皮激素(20-Hydroxyecdysone，20E)和保幼激素(Juvenile Hormone，JH)的嚴(yán)格調(diào)控。典型的程序性細(xì)胞死亡按照其形態(tài)學(xué)分類主要包括:Ⅰ型程序性細(xì)胞死亡即凋亡(apoptosis)，Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡即自噬(autophagy)，Ⅲ型程序性細(xì)胞死亡即壞死(necrosis)。在昆蟲變態(tài)期，受蛻皮激素滴度升高信號的誘導(dǎo)，遺傳級聯(lián)系統(tǒng)調(diào)控

3、的程序性細(xì)胞死亡啟動，低水平自噬轉(zhuǎn)化成為高水平的自噬并誘發(fā)凋亡，細(xì)胞進(jìn)入不可逆的死亡過程。目前雖然不乏關(guān)于昆蟲細(xì)胞自噬與凋亡的研究，但是絕大部分過分關(guān)注凋亡對昆蟲變態(tài)期組織降解的影響，而相對應(yīng)的自噬在昆蟲變態(tài)期功能的研究很少。昆蟲中腸作為研究自噬和凋亡以及兩者之間相互關(guān)系的優(yōu)質(zhì)材料，其在由末齡幼蟲發(fā)育為成蟲的變態(tài)期間發(fā)生中腸重建(midgut remolding)。自噬相關(guān)蛋白4B(Atg4B)是自噬核心蛋白中非常重要的一員，作為一種半

4、胱氨酸蛋白酶切割pro-Atg8蛋白羧基端保守甘氨酸位點(diǎn)后殘基，影響自噬體膜的延伸、閉合以及自噬體的成熟。本論文以棉鈴蟲為模型，研究了Atg4B蛋白在棉鈴蟲變態(tài)發(fā)育時期的功能，闡明了Atg4B參與變態(tài)時期中腸的程序性細(xì)胞死亡，在理論上可以進(jìn)一步了解自噬與細(xì)胞程序性死亡的關(guān)系，并揭示類固醇激素調(diào)控自噬及程序性細(xì)胞死亡的機(jī)理，在應(yīng)用上則能為害蟲防治提供靶標(biāo)基因。
　　研究結(jié)果以及結(jié)論:
　　通過蟲體和細(xì)胞兩個實(shí)驗(yàn)平臺，系統(tǒng)地對基

5、因進(jìn)行干擾和過表達(dá)，研究Atg4B在棉鈴蟲變態(tài)發(fā)育中的功能，揭示了Atg4B參與20E信號誘導(dǎo)的棉鈴蟲蛻皮變態(tài)，以及對棉鈴蟲變態(tài)期中腸的降解發(fā)揮作用。獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和結(jié)論包括:Atg4B在棉鈴蟲幼蟲組織如表皮、中腸和脂肪體均有表達(dá)，而且在蛻皮期和變態(tài)期高表達(dá)，其高表達(dá)被證明是受20E滴度上升的誘導(dǎo)。干擾Atg4B會導(dǎo)致昆蟲在預(yù)蛹期以及蛹期死亡，存活下來的棉鈴蟲則發(fā)生化蛹時間延遲的現(xiàn)象，說明Atg4B對昆蟲的變態(tài)發(fā)育具有調(diào)節(jié)作用。免疫組織

6、化學(xué)顯示，干擾Atg4B會顯著抑制幼蟲舊中腸的降解和成蟲新中腸的形成。在表皮細(xì)胞系上干擾Atg4B后，發(fā)現(xiàn)干擾Atg4B會導(dǎo)致Atg8-RFP羧基端的RFP的切割修飾受阻，影響Atg8與磷脂酰乙醇胺結(jié)合，從而影響自噬體的形成和凋亡的起始。本研究表明20E上調(diào)Atg4B表達(dá)，Atg4B參與昆蟲中腸的自噬過程，影響中腸降解，自噬調(diào)控中腸凋亡。
　　結(jié)論及意義:
　　證明了Atg4B在棉鈴蟲蛻皮期和變態(tài)期高表達(dá)，并且受20E誘導(dǎo)上