Atg4B調(diào)控Bcl--2與Beclin1的解離在氯化鎘誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡與自噬中的機(jī)制研究.pdf

1、鎘(Cd)是一種對(duì)人體有害的元素，可通過(guò)呼吸道或皮膚吸收進(jìn)入人體，因半衰期長(zhǎng)、排泄率低，逐漸累積在人體的各種組織器官中，從而引起多器官損害，甚至促進(jìn)癌癥發(fā)展。研究表明，低劑量的鎘可以誘導(dǎo)凋亡和自噬。越來(lái)越多的研究表明細(xì)胞凋亡與自噬之間存在密不可分的關(guān)系，如自噬相關(guān)蛋白(Atg)12，通過(guò)與Bcl-2家族成員相互作用誘導(dǎo)凋亡。同樣，抗凋亡蛋白Bcl-2家族也可以調(diào)節(jié)自噬。Atg4B作為Atg家族中的一員，在自噬發(fā)生的過(guò)程中具有重要作用。課

2、題組前期研究發(fā)現(xiàn)氯化鎘(CdCl2)通過(guò)誘導(dǎo)活性氧(ROS)產(chǎn)生引起Atg4B表達(dá)上調(diào)，Atg4B上調(diào)誘導(dǎo)的自噬在A549細(xì)胞周期和增殖的變化中起了重要作用。目前沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道Atg4B在凋亡中的作用，且低劑量CdCl2誘導(dǎo)凋亡與自噬的轉(zhuǎn)換機(jī)制也在探索階段。因此，本研究以CdCl2作為研究對(duì)象，探討Atg4B在CdCl2所誘導(dǎo)的凋亡與自噬中的作用。
　　目的:探討Atg4B在CdCl2誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡和自噬中可能的分子機(jī)制。<

3、br>　　方法:本研究以人肺腺癌細(xì)胞（A549細(xì)胞）作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)CdCl2對(duì)A549細(xì)胞凋亡與自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。運(yùn)用吖啶橙(AO)染色法和Hoechst染色法觀察CdCl2對(duì)A549細(xì)胞酸性自噬泡(AVOs)和細(xì)胞核形態(tài)的影響。通過(guò)AO染色法和Western blot檢測(cè)凋亡抑制劑Z-VAD-FMK預(yù)處理后CdCl2對(duì)A549細(xì)胞AVOs和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。使用Weste

4、rn blot和Hoechst染色法檢測(cè)自噬抑制劑3MA預(yù)處理后CdCl2對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和細(xì)胞核形態(tài)的影響。通過(guò)JC-1染色法檢測(cè)3MA預(yù)處理后CdCl2對(duì)A549細(xì)胞中線粒體膜電位(MMP)變化的影響。運(yùn)用siRNA干擾和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，檢測(cè)Atg4B對(duì)CdCl2引起細(xì)胞凋亡的影響。通過(guò)Western blot檢測(cè)線粒體解偶聯(lián)劑CCCP對(duì)Atg4B蛋白表達(dá)的影響。使用JC-1染色法檢測(cè)Atg4B對(duì)MMP的影響。運(yùn)用siRNA

5、干擾和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，檢測(cè)Bcl-2對(duì)CdCl2引起自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，及Bcl-2對(duì)Atg4B介導(dǎo)的自噬與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫共沉淀法檢測(cè)Atg4B、Bcl-2和Beclin1之間相互作用的影響。
　　結(jié)果:2μM CdCl2作用于A549細(xì)胞12和24小時(shí)Cleaved Caspase3、Cleaved Caspase9、胞漿細(xì)胞色素C、Atg4B表達(dá)升高，Bcl-2表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）;

6、Hoechst染色法觀察到CdCl2處理A549細(xì)胞12和24小時(shí)，固縮、碎裂的細(xì)胞核數(shù)量明顯增加(P＜0.01)。說(shuō)明CdCl2在12和24小時(shí)誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。CdCl2處理A549細(xì)胞36和48小時(shí)，LC3-Ⅱ和Beclin1表達(dá)增多，P62表達(dá)降低（P＜0.01）;AO染色結(jié)果可見(jiàn)，CdCl2處理36和48小時(shí)AVOs增多（P＜0.01）。說(shuō)明此時(shí)A549細(xì)胞發(fā)生自噬。Z-VAD-FMK預(yù)處理后CdCl2作用36小時(shí)LC3-

7、Ⅱ、Beclin1表達(dá)較單獨(dú)CdCl2處理組降低，P62表達(dá)升高(P＜0.05，P＜0.01);AO染色結(jié)果可見(jiàn)Z-VAD-FMK預(yù)處理后CdCl2處理組AVOs形成較單獨(dú)CdCl2處理組減少(P＜0.01)。說(shuō)明CdCl2誘導(dǎo)的凋亡對(duì)自噬的發(fā)生有調(diào)控作用。3MA預(yù)處理后CdCl2處理48小時(shí)Cleaved Caspase3、Cleaved Caspase9、胞漿細(xì)胞色素C表達(dá)較單獨(dú)CdCl2處理組升高(P＜0.05，P＜0.01);H

8、oechst染色法觀察到A549細(xì)胞中3MA預(yù)處理后CdCl2作用36和48小時(shí)，固縮、碎裂的細(xì)胞核數(shù)量明顯增加(P＜0.01)。說(shuō)明CdCl2誘導(dǎo)的自噬對(duì)凋亡有抑制作用。為了明確CdCl2誘導(dǎo)的自噬是否通過(guò)穩(wěn)定MMP來(lái)抑制A549細(xì)胞凋亡，通過(guò)JC-1染色法，觀察到3MA預(yù)處理后，MMP恢復(fù)較單獨(dú)CdCl2處理組降低(P＜0.01)。說(shuō)明CdCl2誘導(dǎo)的自噬通過(guò)恢復(fù)MMP來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。在Atg4BsiRNA處理的A549細(xì)胞中，與單

9、獨(dú)CdCl2處理組相比，Cleaved Caspase3、Cleaved Caspase9表達(dá)降低，Bcl-2表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01）;在Atg4B質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞中，隨著Atg4B表達(dá)升高，Cleaved Caspase3、Cleaved Caspase9表達(dá)升高，Bcl-2表達(dá)降低(P＜005，P＜0.01);TUNEL和Hoechst染色法可見(jiàn)凋亡細(xì)胞數(shù)和固縮、碎裂的細(xì)胞核數(shù)量均明顯升高(P＜0.05，P＜0.

10、01)。說(shuō)明Atg4B可以介導(dǎo)CdCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。CCCP（0.5μM）作用于A549細(xì)胞24小時(shí)，檢測(cè)到Atg4B蛋白表達(dá)升高(P＜0.01);采用JC-1染色法，分析證實(shí)在Atg4B siRNA和Atg4B質(zhì)粒處理的細(xì)胞中，MMP沒(méi)有明顯的改變。說(shuō)明MMP改變影響Atg4B蛋白的表達(dá)，而Atg4B的改變對(duì)MMP沒(méi)有明顯的調(diào)控作用。在Bcl-2siRNA處理的A549細(xì)胞中，與單獨(dú)CdCl2處理組相比，LC3-Ⅱ、Beclin1

11、表達(dá)升高，P62表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），Bcl-2過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)LC3-Ⅱ、Beclin1表達(dá)降低，P62表達(dá)升高(P＜0.05)。說(shuō)明Bcl-2可以介導(dǎo)CdCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。通過(guò)Bcl-2和Atg4B質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染技術(shù)，證實(shí)Atg4B通過(guò)Bcl-2介導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡與自噬。蛋白質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，Atg4B通過(guò)與Bcl-2結(jié)合使Bcl-2和Beclin1解離，從而釋放Beclin1，誘導(dǎo)Beclin1依賴(lài)性自噬。