兩種小GTP酶Rab4b,Rab32及蛋白激酶C delta(PKCδ)在棉鈴蟲變態(tài)過程中的功能研究.pdf

1、研究背景：
　　 昆蟲是地球上種類最多，數(shù)量最大的生物種群，與人類有著密不可分的關(guān)系。昆蟲的發(fā)育是由激素調(diào)控的復(fù)雜的生命過程，包括昆蟲的蛻皮與變態(tài)。在全變態(tài)昆蟲中，蛻皮過程包括幼蟲之間的蛻皮，幼蟲到蛹的蛻皮以及蛹到成蟲的蛻皮。幼蟲向蛹的轉(zhuǎn)變被稱為變態(tài)。昆蟲的變態(tài)是受蛻皮激素(20E)和保幼激素(JH)共同調(diào)控的。在幼蟲期，20E引發(fā)蛻皮，JH負(fù)責(zé)維持個(gè)體的幼蟲狀態(tài);而在幼蟲的末齡期，JH滴度逐漸降低甚至消失，20E則起始變態(tài)過程

2、。目前對于20E及JH協(xié)調(diào)調(diào)控變態(tài)的機(jī)制已經(jīng)有了比較深入的研究。但最近的研究表明，除了20E與JH兩種激素外，胰島素(insulin)在昆蟲的變態(tài)中起著不可忽視的作用。研究發(fā)現(xiàn)，insulin與20E存在著相互作用，二者共同的調(diào)控昆蟲的生長及變態(tài)決定。但二者相互作用的分子機(jī)制尚不清楚，有哪些分子參與了兩個(gè)通路的相互作用，還有待進(jìn)一步研究。
　　 昆蟲的變態(tài)過程中伴隨著組織的重建，例如，中腸和脂肪體。在變態(tài)時(shí)期，幼蟲的組織要發(fā)生解

3、體，成蟲的組織重新形成，這一過程也是由20E與JH共同調(diào)控的。20E誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡使幼蟲組織降解，而JH則拮抗20E的功能。然而，組織的重建過程是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，除了激素的調(diào)控外，還依賴于其他的活性分子。但目前對于參與組織重建效應(yīng)分子的研究還不深入。小GTP酶Rab蛋白在哺乳動(dòng)物中廣泛參與了各種生理活動(dòng)，包括膜泡運(yùn)輸，細(xì)胞骨架活性及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程，但在昆蟲發(fā)育過程中對于該類蛋白的研究還很有限。此外，蛋白激酶C作為一種絲氨酸/

4、蘇氨酸蛋白激酶可以通過促進(jìn)底物蛋白磷酸化調(diào)節(jié)多種生理過程，如細(xì)胞生長與增殖，細(xì)胞凋亡等。有研究發(fā)現(xiàn)蛋白激酶C參與昆蟲20E信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，但哪種蛋白激酶C參與20E的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)還有待研究。
　　 存在的科學(xué)問題：
　　 本實(shí)驗(yàn)室通過對棉鈴蟲變態(tài)期轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，鑒定到兩種小GTP酶Rab4b，Rab32及一種蛋白激酶Cdelta(PKCδ)基因。擬解決的科學(xué)問題為:Rab4b，Rab32是否參與由激素調(diào)控的變態(tài)過程？在功能上

5、有何差異？PKCδ是否參與20E調(diào)節(jié)的變態(tài)及其伴隨的組織重建過程？
　　 研究意義：
　　 本研究通過鑒定三種參與變態(tài)過程的關(guān)鍵分子，闡明了不同分子的具體功能，從分子水平上揭示激素調(diào)控變態(tài)的分子機(jī)制，為進(jìn)一步研究昆蟲發(fā)育提供依據(jù)。此外，本研究通過鑒定參與組織重建的效應(yīng)分子，豐富了我們對于組織重建機(jī)制的認(rèn)識和理解，為農(nóng)業(yè)害蟲的防治提供了理論指導(dǎo)。
　　 研究方案及取得的成果：
　　 本文以鱗翅目昆蟲，棉鈴蟲

6、，為實(shí)驗(yàn)材料，通過體內(nèi)，體外的干擾實(shí)驗(yàn)及激素調(diào)控實(shí)驗(yàn)來探索兩種Rab蛋白Rab4b，Rab32及蛋白激酶Cdelta(PKCδ)在昆蟲變態(tài)及組織重建中的功能。所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　 1.Rab4b參與insulin與20E信號通路的基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)而調(diào)控糖原水平及變態(tài)發(fā)生
　　 本研究在棉鈴蟲鑒定到一個(gè)小GTP酶Rab4b參與了20E與胰島素調(diào)控的基因轉(zhuǎn)錄。該基因在表皮、中腸、脂肪體及血淋巴中均有表達(dá)。蟲體RNA干擾導(dǎo)致幼蟲

7、在化蛹前死亡，異常化蛹及小蛹的形成。生化分析結(jié)果顯示，干擾Rab4b后，糖原的儲(chǔ)存水平下降;體內(nèi)及體外干擾實(shí)驗(yàn)表明，20E通路中的Br和HR3以及糖原合成酶GS的轉(zhuǎn)錄水平受到抑制，而FOXO的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫印跡的結(jié)果表明，insulin通過Rab4b抑制FOXO的核定位，過表達(dá)Rab4b進(jìn)行亞細(xì)胞定位檢測，發(fā)現(xiàn)insulin沒有影響Rab4b定位，而20E刺激后Rab4b向細(xì)胞膜遷移。但在mRNA水平上，20E不影響R

8、ab4b的表達(dá)，而胰島素則誘導(dǎo)Rab4b的上調(diào)。暗示20E與胰島素信號通路通過不同的方式來調(diào)控Rab4b，最終調(diào)控變態(tài)的發(fā)生。
　　 2.Rab32參與棉鈴蟲變態(tài)期中腸的重建
　　 我們從棉鈴蟲中腸中鑒定到Rab32基因。半定量RT-PCR分析Rab32表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)該基因在預(yù)蛹期的中腸mRNA水平最高。20E誘導(dǎo)Rab32上調(diào)，而JH類似物(JHA)不影響其轉(zhuǎn)錄。在表皮細(xì)胞系中干擾20E核受體EcR-B1后，20E對Ra

9、b32的上調(diào)作用消除。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，該蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)中，而20E使Rab32在細(xì)胞系中聚集顆粒狀結(jié)構(gòu)并增加Rab32在細(xì)胞質(zhì)中的蛋白表達(dá)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在變態(tài)期的中腸中，Rab32定位與成蟲中腸上皮細(xì)胞的內(nèi)部邊緣位置，暗示其可能參與中腸形成中營養(yǎng)的吸收及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。在蟲體內(nèi)干擾Rab32后，幼蟲的生長及變態(tài)沒有受到影響，但成蟲中腸的形態(tài)發(fā)生異常。這些結(jié)果說明Rab32參與了棉鈴蟲變態(tài)期的中腸重建，Rab32可能在

10、20E信號途徑的調(diào)控下參與成蟲中腸的形成。
　　 3.蛋白激酶Cdelta(PKCδ)參與棉鈴蟲變態(tài)期組織的解體
　　 本研究在棉鈴蟲中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新型的蛋白激酶C，PKCδ，參與了變態(tài)期中腸和脂肪體的凋亡。PKCδ在棉鈴蟲的表皮、中腸、脂肪體中均有表達(dá)，且在變態(tài)期轉(zhuǎn)錄水平較高。體內(nèi)注射激素實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，20E和JHⅢ都可以上調(diào)PKCδ的轉(zhuǎn)錄，。在細(xì)胞系上干擾EcR-B1后，20E不能上調(diào)PKCδ,而干擾JH的候選受體Me

11、t后，JHⅢ對PKCδ的誘導(dǎo)作用沒有變化，說明20E通過EcR-B1周控PKCδ,而JHⅢ可能通過其他的方式，而不是Met來調(diào)控PKCδ轉(zhuǎn)錄。在蟲體中干擾PKCδ,中腸和脂肪體無法進(jìn)行解體和重建;凋亡相關(guān)基因Caspase8的表達(dá)被抑制，而凋亡抑制因子Survivin轉(zhuǎn)錄上調(diào)。在表皮細(xì)胞中過表達(dá)PKCδ的功能域，可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并增強(qiáng)了FOXO的核定位，說明PKCδ可能通過調(diào)節(jié)FOXO的轉(zhuǎn)錄活性誘導(dǎo)凋亡。在表皮細(xì)胞中干擾PKCδ,抑制

12、了20E及JHⅢ對USP1，Calponin等關(guān)鍵基因的上調(diào)作用，說明PKCδ可能參與了20E與JH的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的相互作用。
　　 所取得成果的創(chuàng)新點(diǎn)與意義：
　　 本文主要通過體內(nèi)及體外的RNA干擾技術(shù)，鑒定到一個(gè)小GTP酶Rab4b通過調(diào)控20E與胰島素通路基因轉(zhuǎn)錄及糖原合成進(jìn)而參與變態(tài)。深入揭示了20E通路與胰島素通路相互作用的機(jī)制。同時(shí)，我們鑒定到另一種小GTP酶Rab32參與了中腸重建中成蟲中腸的形成，豐富了