彌漫性掌跖角皮癥及毛囊角化病的基因突變檢測及基因型—表型初步分析.pdf

1、背景：
　　 1、彌漫性掌跖角皮癥的研究背景彌漫性掌跖角皮癥(Diffuse Palmoplantar Keratoderma，DPPK)，是掌跖角化病的遺傳型的一個(gè)最常見的類型。彌漫性掌跖角化病屬于常染色體顯性遺傳，可見于所有種族中。本病多為嬰兒期開始發(fā)病，輕者僅有掌跖皮膚粗糙，重者掌跖處出現(xiàn)彌漫性斑塊狀、邊緣清晰的角質(zhì)增厚，呈黃色胼胝體樣。有時(shí)角質(zhì)增厚可蔓延至掌跖皮膚側(cè)緣或手足背，可伴有指節(jié)墊、甲板增厚渾濁、指趾屈曲畸形等。

2、彌漫性掌跖角皮病根據(jù)其病理特點(diǎn)可分為彌漫性表皮松解性掌跖角化癥(diffuseepidermolytic PPK, DEPPK)和彌漫性非表皮松解性掌跖角化癥(diffusenon-epidermolytic PPK，DNEPPK)2種亞型。表皮松解性掌跖角化癥（EPPK，OMIM#144200），即彌漫性表皮松解性掌跖角化癥(DEPPK)，最初由V(o)rner在1901年報(bào)道，是一種常染色體顯性遺傳病。EPPK與DNEPPK的臨床表

3、現(xiàn)相似，均表現(xiàn)為彌漫性的角化過度，但DNEPPK患者的表皮為非松解性，沒有角質(zhì)形成細(xì)胞的降解和破裂;EPPK患者表皮為松解性，角質(zhì)形成細(xì)胞大量裂解。而EPPK在各個(gè)種族中和臨床上更為常見。
　　 1992年，Reis等通過對德國1個(gè)7代共18例患者的EPPK大家系進(jìn)行的遺傳連鎖分析，將EPPK的候選基因定位于染色體17q21.1-q21.2[1,2]。此部位是Ⅰ型角蛋白基因簇的分布區(qū)域，因此，在掌跖表皮中特異性表達(dá)的Ⅰ型角蛋白K

4、RT9基因自然地被認(rèn)為是EPPK的一個(gè)候選基因。角蛋白是一類中間纖維蛋白，分子數(shù)量多達(dá)30多種，可分為2種類型，Ⅰ型為酸性蛋白，Ⅱ型為中性/堿性蛋白。角蛋白分子是表皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞中間纖維的主要成分。因此，角蛋白突變會(huì)破壞細(xì)胞中間纖維的組裝，形成異常的聚集物，從而削弱細(xì)胞骨架的力量，增加細(xì)胞破裂的風(fēng)險(xiǎn)，引發(fā)某些疾病。角蛋白9(KRT9)是Ⅰ型為酸性蛋白，其幾乎局限性表達(dá)于掌跖部位的皮膚。因此，KRT9基因的突變與表皮疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密

5、切。迄今為止，與EPPK有關(guān)的KRT9基因突變據(jù)文獻(xiàn)所報(bào)道的已經(jīng)多達(dá)25種，主要突變方式為錯(cuò)義突變、堿基缺失或插入。
　　 2、毛囊角化病的研究背景
　　 (1)毛囊角化病的臨床特征
　　 毛囊角化病（Keratosis Follicularis，DD）是一種少見的常染色體顯性遺傳的角化不良性皮膚病。本病出生時(shí)無皮疹，通常10-20歲開始發(fā)病。男女發(fā)病率大致相等。流行病學(xué)研究調(diào)查表明，發(fā)病率1/30，000到1/

6、100，000之間。本病臨床表型多樣，皮疹分布對稱和廣泛。皮損多見于前額、頭皮、背部等皮脂溢出較多的部位。病情嚴(yán)重時(shí)甚至可擴(kuò)展到軀干、腰骶部和外生殖器等處。皮疹初發(fā)常見部位為耳部，面部皮疹常較嚴(yán)重。早期表現(xiàn)為堅(jiān)實(shí)的、紅色或正常膚色的小丘疹。丘疹逐漸增大成疣狀，逐漸趨向融合，形成不規(guī)則的疣狀斑塊或乳頭瘤樣增生。皮疹多對稱分布，但明顯的不對稱或帶狀、痣樣分布也可發(fā)生。可伴有掌跖角化以及特征性甲的改變。此外還可以累及粘膜，如口咽、食管、喉、肛

7、門直腸粘膜。本病常在夏季加重，陽光、高溫、出汗、摩擦等可促發(fā)本病的發(fā)生或加重本病的病情。毛囊角化實(shí)際上并不是一種毛囊性疾病，某些缺乏毛囊的部位，如掌跖和口腔黏膜也可以發(fā)病。
　　 典型組織病理特征
　　 1）特殊形態(tài)的角化不良，形成圓體和谷粒
　　 2）基底層上棘層松解，形成基底層上裂隙和隱窩
　　 3）“絨毛”向上不規(guī)則增生，進(jìn)入隱窩和裂隙內(nèi)
　　 4）有乳頭瘤樣增生、棘層肥厚和過度角化，真皮慢

8、性炎癥性改變。
　　 (2)毛囊角化病致病基因的定位克隆。
　　 毛囊角化病是1889年由Darier和White首次報(bào)告。1993年，Bashir和Craddock等[7]首次將該病的致病基因定位于12q23-q24.1，這正是ATP2A2基因所在位點(diǎn)。已經(jīng)證實(shí)其編碼的肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子-ATP酶2(SERCA2)的突變是引起該疾病的主要遺傳基礎(chǔ)。SERCA2是P型鈣離子ATP酶家族成員中的一員，不僅能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外鈣離

9、子的濃度，而且在維持細(xì)胞鈣離子信號傳導(dǎo)上也起到相當(dāng)重要的作用[8]。在毛囊角化病患者體內(nèi)ATP2A2基因編碼一種功能缺陷的SERCA2。
　　 (3)ATP2A2基因結(jié)構(gòu)、功能及突變。
　　 ATP2A2基因長度約為76kb，由21個(gè)外顯子組成，編碼肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子ATP酶2(SERCA2)。根據(jù)剪接部位不同，可編碼成三個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本。分別是主要表達(dá)于心臟、腦組織和慢速收縮骨骼肌的SERCA2a;分布于平滑肌、表皮等

10、非肌肉組織中的SERCA2b和在上造血細(xì)胞系和單核細(xì)胞中檢測到的SERCA2c。SERCA2二級結(jié)構(gòu)包括頸亞區(qū)、執(zhí)行區(qū)、磷酸化區(qū)、ATP結(jié)合區(qū)、10或11個(gè)跨膜螺旋亞區(qū)(M1-10/11)等，跨膜區(qū)內(nèi)M4、M5、M6、M8存在Ca2+的結(jié)合部位，鉸鏈區(qū)把ATP結(jié)合區(qū)和跨膜蛋白部分連接起來形成一個(gè)完整的功能單位[9]。SERCA2是P型鈣離子ATP酶家族成員中的一員，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外鈣離子的濃度，參與機(jī)體內(nèi)鈣離子信號的傳導(dǎo)，是使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中

11、大量鈣離子聚集的離子泵之一。SERCA2通過轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞漿內(nèi)的鈣離子至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上來維持細(xì)胞漿內(nèi)低鈣離子水平[10]。細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子的水平在表皮細(xì)胞間的連接和調(diào)節(jié)細(xì)胞分化方面具有重要的作用。ATP2A2基因的突變可引起SERCA2功能紊亂，表現(xiàn)為ATP、鈣離子與相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合能力下降，影響ATP的磷酸化作用等。據(jù)報(bào)道，關(guān)于DD的ATP2A2基因的突變在整個(gè)基因內(nèi)散在分布，沒有突變熱點(diǎn)區(qū)域，盡管如此，有研究表示ATP2A2內(nèi)有兩個(gè)突變集合區(qū)

12、，即是位于基因兩端的氨基酸上游的桿狀區(qū)、S1區(qū)和羧基末端跨膜區(qū)[10,11]。然而也有文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)DD突變在ATP2A2基因的中段分布頻率較高，尤其是磷酸化區(qū)和ATP結(jié)合區(qū)[9，12]。
　　 目的：
　　 (1)檢測臨床上所收集的一個(gè)中國掌EPPK家系存在的KRT9基因突變，分析EPPK的臨床特點(diǎn)和突變篩查結(jié)果，以及EPPK的基因型-表型之間的關(guān)系?；仡櫸墨I(xiàn)曾報(bào)道過的有關(guān)EPPK家系的KRT9基因突變的病例，總結(jié)分析K

13、RT9基因的突變位點(diǎn)、突變類型及突變的種族來源等方面的特點(diǎn)，以期獲得有關(guān)KRT9基因和EPPK的更全面的遺傳信息。
　　 (2)檢測我科臨床上收集的2例單發(fā)毛囊角化病病例，并進(jìn)行ATP2A2基因致病性突變的檢測，分析單發(fā)病例的臨床特點(diǎn)及突變結(jié)果，以期獲得更多的有關(guān)ATP2A2基因和DD的基因型和表型的相關(guān)信息。
　　 方法：
　　 (1)家系調(diào)查及病例資料收集:我科臨床上收集一個(gè)患掌跖角皮癥的家系以及2例單發(fā)的毛

14、囊角化病病例的臨床資料，及進(jìn)行家系調(diào)查。
　　 (2)組織病理學(xué)檢查:在局麻下手術(shù)切取EPPK先證者左手掌皮損處的一小塊皮膚組織以及毛囊角化病患者2右肩部的皮損組織，然后行常規(guī)病理檢查。
　　 (3)基因組DNA提取:收集一個(gè)掌跖角化病家系中先證者及其弟弟的外周血樣、該2例的毛囊角化病患者的外周血樣及100份正常對照健康人的外周血樣，并提取外周血樣的DNA。
　　 (4) PCR反應(yīng):設(shè)計(jì)擴(kuò)增KRT9基因突變熱點(diǎn)

15、區(qū)域——第1個(gè)外顯子編碼區(qū)及側(cè)翼序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增ATP2A2基因的21個(gè)外顯子18對引物，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)。
　　 (5)1％瓊脂糖凝膠電泳:PCR反應(yīng)后，DNA產(chǎn)物于1％的瓊脂糖凝膠中電泳，見單一明亮條帶時(shí)可送DNA測序檢測。
　　 (6) DNA測序:采用焦磷酸DNA測序法對EPPK患者、毛囊角化病患者以及正常對照患者的DNA進(jìn)行測序檢測，并進(jìn)行基因突變篩查。
　　 (7)對目前國外文獻(xiàn)所報(bào)道的有關(guān)EPPK的

16、角蛋白9基因突變進(jìn)行總結(jié)分析。查閱Human Intermediate Filament Database(http://www.interfil.org/)及美國國立生物技術(shù)信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)輸入相關(guān)檢索詞，檢索到有關(guān)國內(nèi)報(bào)道的掌跖角化病的病例報(bào)道及相關(guān)突變檢測，對這些病例KRT9基因的突變位點(diǎn)、突變類型及突變的種族來源等進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：
　　 (1) EPPK家

17、系患者的臨床特點(diǎn):先證者，女性，32歲，出生半個(gè)月后雙手掌及足底皮膚即出現(xiàn)彌漫分布的紅斑、鱗屑。隨著年齡的增長，患者掌跖皮膚逐漸增厚，細(xì)小或片狀脫屑，近端指關(guān)節(jié)及腕部掌側(cè)皮膚明顯增厚、隆起，呈胼胝體樣，黃色，質(zhì)硬;雙手指屈曲畸形;趾甲普遍增厚、渾濁，真菌檢測陰性。病情冬季加重，皮膚干燥、皸裂、出血，伴明顯疼痛;夏季減輕。家系調(diào)查:調(diào)查了4代共16人，其中患者6人，男性3人，女性3人。最小患病年齡為1歲半，發(fā)病年齡均為出生后半個(gè)月左右。臨

18、床表現(xiàn)均為彌漫性的掌跖皮膚增厚、鱗屑，嚴(yán)重時(shí)皮膚干燥、皸裂、疼痛，未見其他部位發(fā)病，家族各患病成員的病情輕重相似。
　　 (2)通過對KRT9基因的突變熱點(diǎn)區(qū)域檢測，該家系中兩名患者的血樣被檢測出一個(gè)錯(cuò)義突變，cDNA的第470位的堿基T變成了G，即c.470T＞G，相應(yīng)的氨基酸由甲硫氨酸變成了精氨酸，即p.M157R。而家系外100位正常人的檢測均未發(fā)現(xiàn)該突變。
　　 (3)通過對目前文獻(xiàn)所報(bào)道的角蛋白9基因突變的分析

19、，可以發(fā)現(xiàn)迄今所報(bào)道的KRT9基因突變主要集中在1號外顯子和6號外顯子，最常見的突變位點(diǎn)為cDNA487位的堿基，即第163位氨基酸。25種突變，19種位于1A區(qū)域，6種位于2B區(qū)域，除了在cDNA500位點(diǎn)處缺失堿基A插入四個(gè)堿基GGCT(c.500delAinsGGCT)，即第167位氨基酸酪氨酸轉(zhuǎn)變成色氨酸和亮氨酸(p.Y167delinsWL)外，其余的突變方式均為錯(cuò)義突變。基因型-表型分析顯示:文獻(xiàn)顯示KRT9第163位氨基酸

20、的突變病例均顯示出典型的EPPK臨床表現(xiàn)和病理表現(xiàn)。此外，KRT1突變也可導(dǎo)致一些與掌跖角皮癥相似的臨床表現(xiàn)。
　　 (4)毛囊角化病患者臨床特點(diǎn):患者1，男性，25歲，來自湖南省，發(fā)病年齡較早，5歲時(shí)開始發(fā)病，病史20年左右。皮疹表現(xiàn)為散在分布于額部、腋窩、腹股溝等處皮膚的紅色、粉紅色或皮色的堅(jiān)實(shí)的毛囊角化性小丘疹，針尖至粟粒大小，表面油亮，其他等部位皮膚未見累及，不伴有指甲、掌跖及粘膜損害。患者臨床表現(xiàn)較輕，一般無自覺癥狀，

21、但病情反復(fù)，冬輕夏重，夏天炎熱、多汗時(shí)可覺輕度瘙癢。
　　 患者2，男性，46歲，來自湖南省，青年時(shí)發(fā)病，病史20年左右。緣于患者20余年前無明顯誘因頸部兩側(cè)出現(xiàn)暗紅色小丘疹，片狀密集分布，無明顯自覺癥狀。皮疹逐漸蔓延至腋下、面、胸背、骶尾部皮膚，可見密集角化性暗紅色堅(jiān)實(shí)的毛囊性丘疹，大小不等，局部丘疹增大呈疣狀、融合成斑塊狀，上覆鱗屑。局部皮膚粗糙、肥厚。病情反復(fù)發(fā)作，夏季加重，冬季可自行緩解。病理特點(diǎn):表皮角化過度，局部角化

22、不良，棘細(xì)胞間松解和裂隙，不正常角化的細(xì)胞間可見谷粒和圓體。
　　 (5)通過對ATP2A2基因突變檢測，2例單發(fā)的毛囊角化病病例被檢測出兩個(gè)新的錯(cuò)義突變:c.2098A＞G，c.742C＞A;相應(yīng)的蘇氨酸變成了丙氨酸，即p.T700A，以及相應(yīng)的脯氨酸變成了蘇氨酸，即p.P248T。而家系外100位正常人的檢測均未發(fā)現(xiàn)該突變。
　　 (6)基因型-表型分析顯示:2個(gè)單發(fā)毛囊角化病病例的突變位點(diǎn)不同，病情嚴(yán)重程度不一，患

23、者的發(fā)病年齡也不完全相同。文獻(xiàn)分析也表明:即使是同一家系，同一突變也可導(dǎo)致不同表型，發(fā)病年齡也有差異。因此未能發(fā)現(xiàn)臨床表型和基因型之間的明顯相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 本研究在1個(gè)EPPK家系中檢測出KRT9基因的1個(gè)錯(cuò)義突變，該錯(cuò)義突變?yōu)橹虏⌒酝蛔兌嵌鄳B(tài)性變化。該2例單發(fā)毛囊角化病病例檢測出的突變均為致病性突變而非多態(tài)性變化，且均為國內(nèi)外首次報(bào)道的新突變。
　　 我們的研究結(jié)果進(jìn)一步豐富了有關(guān)角化性皮膚遺傳病