先天性長QT綜合征的基因突變檢測及常見基因型與表現(xiàn)型的相關性研究.pdf

1、研究背景
　　 先天性長QT綜合征(longQTsyndrome，LQTS)屬于遺傳性心律失常，是由于編碼心肌細胞離子通道的基因異常所導致，也被稱為“離子通道病”。LQTS患者具有QT間期延長和T波形態(tài)異常的心電圖特征，臨床表現(xiàn)為反復發(fā)作的暈厥和室性心律失常，尤其是尖端扭轉性室性心動過速(Torsadedepointes，TdP)。據(jù)統(tǒng)計，未經(jīng)治療的LQTS患者的10年死亡率高達50％，且約1/2500的患者終身伴隨猝死風險。美

2、國近年數(shù)據(jù)顯示，LQTS在人群中的發(fā)病率約1:2000～1:5000，尤其多見于兒童和青少年。據(jù)此推算，我國LQTS患者接近30萬。由于LQTS具有發(fā)病突然、猝死率高、青少年多發(fā)的特點，目前已成為遺傳性心律失常的研究前沿和熱點。
　　 1991年，Keating等首次將LQTS的致病基因定位于人類11號染色體，迄今已發(fā)現(xiàn)至少13個基因與LQTS相關。根據(jù)不同基因把LQTS劃分為13個亞型:KCNQ1(LQT1)、KCNH2(LQ

3、T2)、SCN5A(LQT3)、ANK2(LQT4)、KCNE1(LQT5)、KCNE2(LQT6)、KCNJ2(LQT7)、CACNA1C(LQT8)、CAV3(LQT9)、SCN4B(LQT10)、AKAP9(LQT11)、SCNA1(LQT12)和KCNJ5(LQT13)。這些致病基因通過錯義突變、缺失/插入突變、移碼突變和剪接突變等多種方式造成心肌離子通道功能異常。全世界已發(fā)現(xiàn)LQTS致病基因上的900多個突變位點。然而研究發(fā)現(xiàn)

4、，不同種族的突變位點存在差異，例如LQT1～LQT3基因型的非同義突變在白種人中約4％，而其他人種約6～8％。也就是說，LQTS患者的致病基因基本相同，而突變位點不盡相同。因此，基因篩查尤為必要。隨著分子遺傳學的發(fā)展，歐美已逐漸將基因檢測作為明確LQTS診斷的一種臨床手段。2011年，美國心律學會和歐洲心律學會聯(lián)合發(fā)表了《心臟離子通道病與心肌病基因檢測的專家共識》，該共識對LQTS最常見的3種致病基因(KCNQ1、KCNH2和SCN5A

5、)篩查做了重點推薦，其中，臨床診斷明確以及高度可疑的LQTS患者均被建議進行上述基因檢測。近幾年，我國研究者共發(fā)現(xiàn)約50個與國人LQTS相關的突變位點。由于基因檢測價格昂貴，目前我國針對LQTS的基因檢測多用于科研，臨床遠未普及。
　　 LQTS的臨床診斷主要基于患者靜息心電圖的QTc數(shù)值、暈厥病史及心源性猝死家族史。然而，約10～40％的患者和致病基因攜帶者的靜息QTc值正常。因此，對臨床高度可疑的患者篩查特定基因十分重要。有

6、報道稱，有明顯LQTS臨床表現(xiàn)的患者，其致病突變的檢出率約75％。Tester等研究發(fā)現(xiàn)，LQTS的特定基因型和表現(xiàn)型密切相關，尤其是LQT1～LQT3型患者，其心電圖T波形態(tài)和發(fā)病誘因都具有顯著特征。如LQT1型患者的典型T波表現(xiàn)為基底部寬大且上升支和下降支光滑;LQT2的T波特征是低平或雙峰狀;LQT3則以延遲出現(xiàn)的高尖雙相T波為特有表現(xiàn)。在發(fā)病誘因方面，LQT1型患者多在運動、游泳等交感神經(jīng)興奮時發(fā)生暈厥或猝死，LQT2和LQT3

7、型患者則于休息或睡眠時多發(fā)心血管事件。值得關注的是，聽覺刺激是LQT2的特定觸發(fā)因素。特異的臨床表現(xiàn)不僅有利于進行靶基因檢測，從而明確基因型，而且有助于制定個體化治療方案。由于LQTS各基因型的發(fā)病機制不同，患者對藥物的敏感程度并不相同。作為首選用藥，β受體阻滯劑能顯著減少LQT1患者的暈厥次數(shù);LQT2患者服藥后的暈厥復發(fā)率仍較高;而對于鈉通道基因突變導致的LQT3型，β受體阻滯劑往往效果較差，應首選ICD治療。由此可見，基于臨床特征

8、的基因篩查能提高診斷率以及更有效地指導治療。LQTS包括兩種遺傳方式，分別是常染色體顯性遺傳的Romano-Ward綜合征(RWS)和常染色體隱性遺傳的JervellandLange-Nilsen綜合征(JLNS)。RWS最常見的致病基因為KCNQ1和KCNH2，KCNQ1和KCNE1是JLNS的致病基因。根據(jù)指南推薦，首先篩查出LQTS先證者的突變基因，再對家系成員進行相同位點的基因檢測。不攜帶先證者的致病突變是家系成員排除LQTS的

9、唯一方法。
　　 本研究中，我們收集了3例LQTS先證者及其家系成員的臨床資料并進行分析，力圖明確LQTS的常見基因型和表現(xiàn)型的關聯(lián)性。同時，在根據(jù)T波形態(tài)預測基因型后，我們篩查了各先證者的相關基因;待發(fā)現(xiàn)突變，再檢測該家系成員的相同位點，以期發(fā)現(xiàn)國人LQTS相關的基因突變。
　　 研究目的
　　 1、本研究收集了3例LQTS先證者及其家系成員共22人的臨床資料，通過分析研究對象的病史、發(fā)病誘因、靜息心電圖QTc

10、值及T波特異形態(tài)，力圖明確LQT1型和LQT2型患者基因型和表現(xiàn)型的關系。
　　 2、本研究篩查了1例JLNS先證者的KCNQ1和KCNE1基因;篩查了2例RWS先證者的KCNQ1和KCNH2基因，待檢測出突變位點后，再對其家系成員進行相同位點的基因檢測，以期發(fā)現(xiàn)LQTS的基因突變位點。
　　 研究對象
　　 依據(jù)Schwartz等提出的先天性長QT綜合征診斷評分標準:≥4分診斷為LQTS患者，且為入選標準。對2

11、007年3月至2011年3月在南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院心內科的住院患者進行篩查，共確診3例LQTS先證者，男1例，女2例，均為漢族，來自廣東省。結合2011年HRS/EHRA發(fā)表的共識中關于LQTS基因篩查的推薦，對先證者及家系成員（包括先證者的同代、子女及父母）共22人進行了臨床資料收集。100名來自體檢中心的健康成人參與了本研究。上述研究對象均已知情同意。
　　 所有研究對象均已排除血管迷走性暈厥、直立性低血壓、致心律失常性

12、右室心肌病、兒茶酚胺型室性心動過速以及獲得性長QT綜合征的各種病因，包括:1、藥物引起的QT間期延長:抗心律失常藥物、抗生素、抗精神病藥物、化療藥物等;2、電解質紊亂及全身系統(tǒng)疾病:低鉀血癥、低鈣血癥，糖尿病、結締組織病，腎功能衰竭、嗜鉻細胞瘤等;3、器質性心臟病:冠心病、心肌肥厚、心力衰竭、心肌病、二尖瓣脫垂等。
　　 研究方法
　　 1、收集并分析先證者及家系成員的臨床資料，記錄安靜狀態(tài)下12導聯(lián)同步心電圖。采用Sc

13、hwartz評分系統(tǒng)診斷LQTS，并根據(jù)Zhang等提出的特異T波形態(tài)預測患者基因型。必要時行24h動態(tài)心電圖或運動試驗明確診斷。臨床資料包括患者是否出現(xiàn)暈厥和首次發(fā)作時間、暈厥的誘發(fā)因素（運動、情緒激動或安靜、睡眠等）、是否有心源性猝死家族史及既往診治情況等。抽取所有研究對象外周血5ml，EDTA法抗凝，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　 2、采用常規(guī)苯酚-氯仿法提取外周血白細胞基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計檢測提

14、取產物并置于-20℃保存。參照Splawski和Syrris等的相關研究設計KCNQ1基因的17對引物、KCNE1基因的3對引物和KCNH2基因的19對引物，交由上海英濰捷基生物公司合成。采用聚合酶鏈反應(PCR)擴增三個基因的全部外顯子。PCR反應體系如下:采用Platinum(○R)Taq反應體系共25uL，除了1uL模板DNA，其余24uL的Supermix組成為:10×PCR緩沖液2.5uL，2.5mMdNTP混合液2uL，50

15、mMMgCl20.75uL，5uM上游及下游引物各1uL，Platinum(○R)TaqDNA聚合酶0.2uL，其余加入滅菌蒸餾水補足體積。上述反應體系的擴增條件為:94℃預變性5min，94℃變性30s，58℃退火45s及72℃延伸90s，經(jīng)過35個循環(huán)后，再以72℃5min延伸，終末以4℃保存。PCR完成后采用1.5％瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定，對于電泳結果不滿意的，重新優(yōu)化反應體系和反應條件，直至最佳效果。最后由上海英濰捷基生物公司采

16、用3730XL型DNA測序儀對擴增產物直接測序。測序結果應用Chromas軟件進行BLAST同源比較，如有堿基改變，則在NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫中查找，確定是否為已公布的變異位點，明確是否存在氨基酸序列改變。擴增家系成員該變異位點的相應外顯子，并進行基因檢測分析。同時篩查100名正常對照成員。
　　 結果
　　 1、Schwartz評分≥4分者3例，診斷為LQTS。其中男1例，女2例，年齡23～46歲，首次發(fā)病年齡15～4

17、6歲，QTc值486～582ms。評分為2～4分者2例，為臨床可疑病例。余家系成員評分均≤1。家系成員B2，評分為1，經(jīng)基因檢測診斷為致病基因攜帶者。研究對象中5例有暈厥史，其中4例在情緒刺激、運動或勞累時誘發(fā)，1例于夜間休息、睡眠中發(fā)作。1例有猝死家族史，隨訪過程中研究對象均未發(fā)生猝死。T波形態(tài)預測基因型:LQT1型2例，LQT2型2例，未發(fā)現(xiàn)其它基因型。1例家系成員的的心電圖特征不明顯，無法預測。家系A先證者及其子均伴先天性耳聾，屬

18、于JLNS;B和C為RWS家系。先證者A1和C1服用β受體阻斷劑有效，B1效果差。
　　 2、DNA測序結果顯示先證者B1及哥哥B2存在KCNQ1基因突變，該突變位點在第6號外顯子上，表現(xiàn)為第830個核苷酸C（胞嘧啶）突變?yōu)門（胸腺嘧啶），導致編碼Iks的α亞單位第277位密碼子由絲氨酸(TCG)突變?yōu)榱涟彼?TTG)。此錯義突變S277L位于KCNQ1的跨膜片段上。該家系其余成員及100名正常對照者均未發(fā)現(xiàn)該突變，NCBI基因