EB病毒LMP1調控Op18-stathmin信號傳導機制的研究.pdf

1、EBV與鼻咽癌發(fā)病密切相關。在鼻咽癌細胞中，EBV潛伏感染時主要表達兩種潛伏膜蛋白LMP1、LMP2，其中LMP1已被確證具有瘤蛋白功能，可以促進B淋巴細胞、上皮細胞轉化，使永生化的細胞具有致瘤性。我們已經證實，EB病毒瘤蛋白LMPl可以異常激活AP-1、NFkB、STAT三條信號轉導通路和磷酸化這三條信號通路中的EGFR，JNK，JAK，STAT，IkB，c-Jun等蛋白質分子，影響細胞周期進程，促進細胞的生長發(fā)育與分化增殖。

2、 EB病毒瘤蛋白LMP1調節(jié)的下游磷酸化蛋白質分子，重要的信號分子或下游功能效應蛋白質分子，遠遠沒有得到全面地闡明。我們前期利用磷酸基團金屬離子親和層析(PMAC)技術富集磷酸化蛋白質策略，結合蛋白質組學高通量技術，在LMP1介導AP-1、NFkB和STAT三條信號轉導通路的基礎上，依據生物信息學預測，建立了LMP1介導的信號轉導通路虛擬網絡，獲得了25個新的受LMP1調控的差異磷酸化蛋白質分子，其中包括Op18/stathmin。

3、 確立LMP1通過MAPK與cdc2介導的對Op18/stathmin信號通路，將進一步完善了LMP1信號通路的調控網絡，確立Op18/stathmin為LMP1的一個新的效應分子提供分子證據，對闡明LMP1在癌變中的分子機制有重要的意義。 1.LMPl對Op18/stathmin表達與磷酸化調節(jié)CNE1是LMP1陰性的鼻咽癌細胞，CNE1-LMP1是穩(wěn)定表達LMP1的鼻咽癌低分化鱗狀癌細胞；LMP1受DOX誘導表達的Tet

4、-on-LMP1-HNE2鼻咽癌細胞；來源于SV40T轉化的永生化鼻咽部上皮細胞NP69、NP69-PIMSX、NP69-LMP1的NP69細胞系列。通過不同細胞株的研究表明，鼻咽癌細胞與人永生化鼻咽部細胞，LMP1對Op18/stathmin表達沒有影響，也沒有時間與劑量依賴性；LMP1顯著誘導Op18/stathmin磷酸化水平上調；但在鼻咽部黏膜上皮細胞轉化的永生化細胞NP69系列，LMP1誘導Op18/stathmin磷酸化改變

5、不明顯。LMP1調節(jié)Op18/stathmin主要通過影響Op18/stathmin磷酸化實現(xiàn)的，其對腫瘤細胞與永生化的細胞作用機制可能存在一定的差異。 2.LMP1通過MAPK對Op18/stathmin信號通路的調控在鼻咽癌細胞中，LMP1能否通過MAPK調控Op18/stathmin信號通路。LMPl陰性的CNE1與穩(wěn)定表達LMP1的CNE1-LMP1鼻咽癌低分化鱗狀癌細胞系，通過細胞同步化，特異阻斷MAPK信號通路，免疫

6、共沉淀，可溶性與聚合性微管蛋白的萃取，Western-blot分析等方法，研究LMP1對MAPK激酶活性影響，MAPK與Op18/stathmin相互作用的改變，微管動力學變化，及LMP1調控MAPK活性改變與細胞周期的相關性。 研究發(fā)現(xiàn)，當細胞絕大部分處于G1/S期，LMP1上調p38、ERK、JNK/MAPK磷酸化，其中ERK磷酸化水平顯著升高；當絕大部分細胞處于G2/M期時，與G1/S期剛好相反，LMP1負性調控p38、E

7、RK和JNK/MAPK激酶磷酸化，ERK磷酸化水平下降最為顯著。 為了證實Op18/stathmin失穩(wěn)定微管的活性，我們設計了靶向Op18/stathmin的siRNA重組載體，觀察在Op18/stathmin基因表達被抑制情況下，微管動力學的改變。研究發(fā)現(xiàn)，RNAi有效抑制Op18/stathmin轉錄及Op18/stathmin蛋白表達；轉染pGCsi.U6/neo/GFP空白質粒與pGCsi.U6/neo/GFP-NON

8、無意義質粒的對照組中，可溶性微管蛋白水平無明顯變化，但轉染pGCsi.U6/neo/GFP-RNAi質粒的處理組，可溶性微管蛋白水平明顯下降。證實，在鼻咽癌細胞中，活性Op18/stathmin促進微管解聚，抑制Op18/stathmin活性表達，將促進微管的穩(wěn)定。 采用免疫共沉淀方法，確定DZ1阻斷LMP1表達的情況下，MAPK與Op18/stathmin相互作用及與LMP1調控關系。結果可見，隨DZ1抑制濃度加大，與Op18

9、/stathmin相互作用的MAPK磷酸化水平下降；DZ1阻斷可導致可溶性微管蛋白比例增加，聚合性微管蛋白比例減少，與LMP1正性調控MAPK激酶活性，導致Op18/stathmin磷酸化水平增加，失穩(wěn)定微管活性下降，促進微管聚合作用相一致。由于未經秋水仙胺處理細胞絕大多數處于G1/S期(83.9％)，說明在G1/S期，LMP1通過誘導MAPK激酶表達與磷酸化介導Op18/stathmin磷酸化失活，促進微管聚合，保證間期微管的相對穩(wěn)定

10、。 PD98059選擇性阻斷MAPK家族中的主要傳導通路ERK/MAPK，隨PD98059濃度抑制劑濃度增加，P-Op18水平有所下降，微管解聚，聚合性微管蛋白比例下降。 在G1/S期，LMP1通過MAPK介導正性調控Op18/stathmin信號；在G2/M期，LMP1通過MAPK介導負性調控Op18/stathmin的信號；在MAPK家族，LMP1主要通過ERK/MAPK介導影響Op18/stathmin信號，是主要

11、的調控途徑。G2/M期，LMP1負性調節(jié)MAPK活性機制有多種可能性，如ode2、p53等的參與。 3.LMP1通過cdc2調控Op18/stathmin信號通路 由于Op18/stathmin信號傳導與細胞周期密切相關，而cdc2是一種有絲分裂期依賴激酶，細胞周期的正向調控子，我們進一步檢測cdc2活性變化與LMP1相關性，探索LMP1通過cdc2介導Op18/stathmin信號通路的調控。 采用M期細胞同步

12、化處理，cdc2激酶活性分析，免疫共沉淀分析cdc2與Op18/stathmin相互作用，微管動力學分析與免疫熒光分析等發(fā)現(xiàn)，LMP1不影響cdc2表達；M期，LMP1顯著上調cdc2的Thr161磷酸化與cdc2激酶活性，Op18/stathmin磷酸化水平同步升高。CO-IP-Westem-blot分析發(fā)現(xiàn)，LMP1促進cdc2與Op18/stathmin相互作用，這種相互作用在M期被顯著增強；免疫熒光與Western-blot分析

13、發(fā)現(xiàn)，有絲分裂期，LMP1誘導紡錘體微管形成，與Op18/stathmin磷酸化失活，促進微管聚合作用相一致。特異性靶向LMP1的脫氧核酶抑制劑DZ1抑制LMP1表達后，cdc2激酶活性下調，cdc2與Op18/stathmin相互作用減弱，聚合性微管蛋白比例下降；CDK1阻斷劑Purvalanol A能有效抑制cdc2激酶活性，抑制Op18/stathmin磷酸化，促進微管解聚，進一步說明LMP1可以通過cdc2介導調節(jié)Op18/st

14、athmin信號通路。 小結： 我們采用鼻咽癌細胞為模型，采用細胞同步化，可溶性與聚合性微管蛋白萃取，免疫熒光，Western-blot分析等技術，結合信號傳導中信號阻斷策略，研究LMP1對Op18/stathmin信號通路的調控，取得了如下發(fā)現(xiàn)： 1)LMP1不影響Op18/stathmin表達，但上調Op18/stathmin磷酸化。對鼻咽部上皮細胞轉化的永生化細胞NP69系列影響不明顯，提示在鼻咽癌細胞與鼻

15、咽部黏膜上皮細胞，LMP1調節(jié)Op18/stathmin信號通路機制可能存在差異。 2)在鼻咽癌細胞，首次證明LMP1對MAPK活性調控與細胞周期相關聯(lián)。在G1/S期，LMP1正性調節(jié)MAPKs系列激酶；在G2/M期，負性調節(jié)MAPKs激酶活性，其中ERK/MAPK是其主要的調控途徑；靶向Op18/stathmin的RNAi實驗證實，Op18/stathmin在NPC細胞是一種微管失穩(wěn)定活性分子，抑制Op18/stathmin的

16、表達，會促進微管聚合。在G1/S期，LMP1促進MAPK與Op18/stathmin相互作用。LMP1通過MAPK介導的Op18/stathmin信號通路的調控，主要發(fā)生在G1/S期，與間期的微管穩(wěn)定性有關。 3)LMP1對細胞周期正向調控因子cdc2的表達無影響，但LMP1能上調cdc2的Tbr161的磷酸化水平，促進M期cdc2激酶活性顯著上升；在M期，LMP1誘導Op18/stathmin磷酸化水平顯著上升，與cdc2激酶

17、活性改變一致；LMP1促進cdc2與Op18/stathmin相互作用，促進有絲分裂期紡錘體微管的聚合。LMP1通過ode2介導的Op18/stathmin信號通路的調控，主要發(fā)生在M期，與有絲分裂期紡錘體形成有關。 以上結果證明：LMP1能通過MAPKs與cdc2激酶調控Op18/stathmin信號通路，影響微管聚合與解聚的動態(tài)平衡，這種作用與細胞周期密切相關，具有細胞周期特異性。兩條信號通路作用機制不一樣，其調控的生物學效