大腸桿菌質(zhì)粒耐藥基因分布及其多態(tài)性研究.pdf

1、目的：
　　 本文主要研究了臨床上最為常見(jiàn)的重要致病菌大腸桿菌的耐藥質(zhì)粒所攜帶的耐藥基因種類(lèi)豐度及其多態(tài)性分布。細(xì)菌耐藥性的改變,往往與細(xì)菌所攜帶的耐藥基因通過(guò)各種途徑傳播有關(guān)。耐藥基因常位于耐藥菌所攜帶的質(zhì)粒上,可通過(guò)質(zhì)?；蛸|(zhì)粒所攜帶的可移動(dòng)元件在細(xì)菌群體中播散。因此,我們通過(guò)對(duì)來(lái)自不同年份大腸桿菌質(zhì)粒DNA序列進(jìn)行高通量測(cè)序,從基因水平研究和分析大腸桿菌質(zhì)粒DNA所攜帶的耐藥基因的種類(lèi),數(shù)量以及多態(tài)性分布,為進(jìn)一步分析大腸桿

2、菌質(zhì)粒所攜帶的耐藥基因演變規(guī)律和分子進(jìn)化研究打下基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 本課題以溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院臨床得到320株大腸桿菌作為本實(shí)驗(yàn)菌株來(lái)源,其中樣本一2002-2003年160株,樣本二2008-2009年160株。采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA,并經(jīng)電泳實(shí)驗(yàn)證實(shí),再將全部質(zhì)粒DNA送交深圳華大基因研究院進(jìn)行solexa測(cè)序,將兩個(gè)樣本測(cè)序得到的短序列通過(guò)一系列的生物信息學(xué)工具分別與從NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)

3、中收集到的耐藥基因序列分別進(jìn)行比對(duì)分析,找出兩個(gè)樣本里所包含的耐藥基因類(lèi)型及豐度的差異,同時(shí)找出這些耐藥基因存在的核苷酸多態(tài)位點(diǎn),分析是否存在新的亞型。
　　 結(jié)果：
　　 1.第1個(gè)樣本(E1)中的測(cè)序結(jié)果產(chǎn)生solexa reads總數(shù)為11,077,768,其中可以定位到所收集到的耐藥基因參照序列上的約占1.76％。第2個(gè)樣本(E2)中的測(cè)序結(jié)果產(chǎn)生solexa reads總數(shù)為9,377,792,可以定位到收集到

4、的參照序列上的序列約占1.44％。
　　 2.在兩個(gè)樣本的大腸桿菌質(zhì)粒中含有大量的耐藥基因,包括β-內(nèi)酰胺類(lèi)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、磺胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、氯霉素類(lèi)、利福平類(lèi)和甲氧芐氨嘧啶等9個(gè)抗生素抗性家族共計(jì)36種耐藥基因型,其中有4種基因型只在E1樣本中出現(xiàn)。
　　 3.兩個(gè)樣本所涉及的所有耐藥基因共發(fā)現(xiàn)128個(gè)位點(diǎn)存在多態(tài)現(xiàn)象,其中第一個(gè)樣本中63個(gè),第二個(gè)樣本中65個(gè)。同一個(gè)位點(diǎn)的A/G二核苷酸多態(tài)是最常

5、見(jiàn)的多態(tài)現(xiàn)象。平行對(duì)比兩個(gè)樣本的所有耐藥基因,共發(fā)現(xiàn)7個(gè)SNP位點(diǎn),他們分布于5個(gè)基因型中,其中有4個(gè)是非同義突變,即核苷酸的多態(tài)性引起了氨基酸的變化。
　　 4.在大腸桿菌質(zhì)粒樣本E1中,發(fā)現(xiàn)一個(gè)染色體編碼的β-內(nèi)酰胺酶blaKluc成員,分析發(fā)現(xiàn)該酶與Kluc-2在氨基酸水平上有98％的相似性,并且其覆蓋度達(dá)到50乘。
　　 5.在E1和E2兩個(gè)樣本中,我們均發(fā)現(xiàn)了一個(gè)oqxAB基因,該基因于2009年首次被發(fā)現(xiàn)存在

6、于人源的大腸桿菌質(zhì)粒上,在本次收集到的人源大腸桿菌質(zhì)粒中,同樣發(fā)現(xiàn)其存在。
　　 6.tem,strB,strA,flop,aacC2五個(gè)基因型始終是兩個(gè)臨床細(xì)菌樣本中最為流行的抗生素耐藥基因型。
　　 結(jié)論：
　　 首先,在方法學(xué)上表明新一代高通量測(cè)序技術(shù)非常適合用來(lái)分析多重耐藥細(xì)菌的質(zhì)?；蚪M的耐藥基因分布及遺傳變異規(guī)律,即便在沒(méi)有精確參照序列的情況下,同樣可以檢測(cè)和發(fā)現(xiàn)樣本中存在的基因型。同時(shí)也表明,一個(gè)L