日本對蝦CyclinB基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的表達.pdf

1、cvclin B又稱細胞周期蛋白B，在G2期或G2/M轉(zhuǎn)變期發(fā)揮著重要的作用。調(diào)節(jié)亞基cyclin B和催化亞基P34cdc2結(jié)合，組成M期促進因子MPF(M phase promoting factor)，又稱成熟促進因子(maturation promoting factor)，為物種間高度保守的啟動細胞由G2期進入M期的一個非常重要的蛋白激酶。在卵母細胞減數(shù)分裂成熟過程中起中心調(diào)控作用。在哺乳類和魚類中研究發(fā)現(xiàn)MPF激活主要依賴于

2、cclin B蛋白合成及P34cdc2的142Thr(蘇氨酸)和152Tyr(酩氨酸)位點發(fā)生去磷酸化。在此過程中細胞周期蛋白B及其相關調(diào)控蛋白 Mos，mytl，和plxl，cdc25蛋白起了關鍵性的作用。有關cyclin B的研究目前主要集中在人、鼠等哺乳動物以及爪蟾、海星和一些魚類(如鯉魚，鯰魚，金魚)。相比于其它類的卵生動物，甲殼類動物的卵母細胞成熟調(diào)控的研究卻極少。 為了進一步在蛋白水平研究cyclin B在日本對蝦卵

3、母細胞成熟過程中的作用，我們擬構(gòu)建cyclin B原核表達體系，并對其表達產(chǎn)物進行初步純化。首先.根據(jù)已知的序列設計兩條特異引物，摸索條件進行目的基因的PCR擴增。經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定在1290bp處出現(xiàn)特異性擴增條帶，片斷大小與預期值相符，且無非特異性擴增帶，可判斷成功擴增出目的基因。接著將cyclin B片段連接到溫度誘導表達質(zhì)粒pBV220上，構(gòu)建pBV220/cyclin B重組子，用菌落PCR和雙酶切方法篩選陽性克隆，并DNA測序

4、進行鑒定。經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切鑒定及DNA測序證實pBV220/cyclin B序列與理論值基本一致，僅第105和110位的氨基酸的密碼子有差異，我們測的第105位的密碼子是GCA，第110位的密碼子是CTT，而報道的是GCC和CTG，雖然密碼子不同，可翻譯過來卻是相同的氨基酸，這樣雖基因序列有所差異，但氨基酸序列卻是完全一樣的。最后把陽性重組子分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達宿主菌JM109、DH5a、BL21(DE3)中，溫度誘導表達，選擇表達