酒精性肝病創(chuàng)傷弧菌膿毒癥大鼠肝組織TLR和促-抗炎細(xì)胞因子的基因表達(dá)及抗菌藥物干預(yù).pdf

1、目的：探討酒精性肝病創(chuàng)傷弧菌膿毒癥大鼠肝組織TLR和促/抗炎細(xì)胞因子的基因表達(dá)以及抗菌藥物頭孢哌酮鈉聯(lián)用乳酸左旋氧氟沙星對(duì)其的干預(yù)效應(yīng)。 方法： 1、清潔級(jí)雄性SD大鼠100只，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將大鼠分為兩組，即酒精性肝病組(90只)和正常對(duì)照組(10只)。酒精性肝病組大鼠按參考文獻(xiàn)[1]用56％的酒精(5g/kg體重)每24小時(shí)灌胃1次，正常對(duì)照組以等容積的生理鹽水灌胃，共10周。隨機(jī)取正常對(duì)照組(N組)存活大鼠6只。取

2、酒精性肝病組存活大鼠60只，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將大鼠分為10組，每組6只。1組為酒精性肝病組(A組)。4組大鼠下肢皮下注射創(chuàng)傷弧菌懸液，為酒精性肝病創(chuàng)傷弧菌膿毒癥組(AV組)，于染菌后2h、6h、12h、24h處死。4組在注射創(chuàng)傷弧菌后4h起，予腹腔注射(ip)頭孢哌酮鈉和乳酸左旋氧氟沙星，每日2次，為酒精性肝病創(chuàng)傷弧菌膿毒癥抗菌藥物治療組(AVA組)，分別在注射創(chuàng)傷弧菌后6h、12h、24h、10d處死。余1組酒精性肝病大鼠注射等量抗菌藥

3、物，為酒精性肝病抗菌藥物對(duì)照組(AA組)。各時(shí)相點(diǎn)動(dòng)物數(shù)均為6只。無(wú)菌取部分肝組織于液氮中保存待用。 2、第10周末隨機(jī)選取酒精性肝病組大鼠2只，麻醉后處死，取肝組織送檢病理。取酒精性肝病組及正常對(duì)照組大鼠下腔靜脈血，檢測(cè)血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)。 3、觀察AV組和AVA組大鼠在染菌及藥物干預(yù)后的體溫、呼吸、精神狀態(tài)等情況的改變。 4、采用Trizol試劑提取各組大鼠肝組織總RNA，紫

4、外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，以總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后以cDNA為模板，以大鼠TLR2、TLR4、MD-2、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)成像，QuantityOne分析軟件進(jìn)行分析，以(目的基因/β-actin)為該基因表達(dá)的相對(duì)值。 5、實(shí)驗(yàn)資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，應(yīng)用SPSS12.0進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析等處理。

5、p＜0.05為差異有顯著性意義。 結(jié)果： 1、大鼠肝臟病理及肝功能檢查酒精性肝病組大鼠肝組織可見(jiàn)脂肪肝，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大小不一的脂滴空泡，竇內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、增生，匯管區(qū)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)。酒精性肝病組大鼠血清AST、ALT水平較正常對(duì)照組明顯升高，差異有顯著性(P＜0.01)。 2、AV組染菌后6h，大鼠開(kāi)始出現(xiàn)較明顯的毒血癥狀，表現(xiàn)為呼吸加快，皮溫升高，下肢腫脹。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，膿毒癥癥狀表現(xiàn)得越明顯。到24h大鼠表現(xiàn)為紫

6、紺、間斷抽搐等；AVA組在藥物干預(yù)后上述癥狀逐漸減輕，大鼠均存活。 3、N組、A組、AA組大鼠肝組織TLR2mRNA表達(dá)量較低。AV組染菌后2h、6h、12h、24h的大鼠肝組織TLR2mRNA表達(dá)量均明顯高于N組與A組(P＜0.05或P＜0.01)，以染菌后12h為最高。AVA組染菌后6h、12h肝組織TLR2mRNA表達(dá)量仍明顯高于N組及AA組(P＜0.05)，后逐漸降低。與相同時(shí)間點(diǎn)的AV組相比，染菌后6h、12h、24h

7、時(shí)的AVA組TLR2mRNA表達(dá)量均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。 4、N組、A組、AA組大鼠肝組織TLR4mRNA表達(dá)量較低。AV組染菌后2h、6h、12h、24h的大鼠肝組織TLR4mRNA表達(dá)量均明顯高于N組與A組(P＜0.05或P＜0.01)，以染菌后12h為最高。AVA組染菌后6h、12h肝組織TLR4mRNA表達(dá)量明顯高于N組(P＜0.05或P＜0.01)，染菌后6hTLR4mRNA表達(dá)量明顯高于AA組(P

8、＜0.05)，后逐漸降低。與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的AV組相比，染菌后6h、12h、24h時(shí)的AVA組TLR4mRNA表達(dá)量均明顯降低(P＜0.01)。 5、N組、A組、AA組大鼠肝組織MD-2mRNA表達(dá)量較低。AV組染菌后2h、6h、12h、24h的大鼠肝組織MD-2mRNA表達(dá)量均明顯高于N組與A組(P＜0.05或P＜0.01)，以染菌后12h為最高。AVA組染菌后6h、12h肝組織MD-2mRNA表達(dá)量仍明顯高于N組與AA組(P＜0

9、.01)，后逐漸降低。與相同時(shí)間點(diǎn)的AV組相比，染菌后6h、12h、24h時(shí)的AVA組MD-2mRNA表達(dá)量均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。 6、N組、A組、AA組大鼠肝組織TNF-αmRNA表達(dá)量較低。AV組染菌后2h、6h、12h、24h的大鼠肝組織TNF-αmRNA表達(dá)量均明顯高于N組與A組(P＜0.05或P＜0.01)，以染菌后24h為最高。AVA組染菌后6h、12h肝組織TNF-αmRNA表達(dá)量仍明顯高于N組

10、與AA組(P＜0.01)，后逐漸降低。與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的AV組相比，染菌后12h、24h時(shí)的AVA組TNF-αmRNA表達(dá)量均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。 7、N組、A組、AA組大鼠肝組織IL-1βmRNA表達(dá)量較低。AV組染菌后2h、6h、12h、24h的大鼠肝組織IL-1βmRNA表達(dá)量均明顯高于N組與A組(P＜0.05或P＜0.01)，以染菌后24h為最高。AVA組染菌后6h、12h、24h肝組織IL-1βmRNA

11、表達(dá)量仍明顯高于N組與AA組(P＜0.05或P＜0.01)，后逐漸降低。與相同時(shí)間點(diǎn)的AV組相比，染菌后12h、24h時(shí)的AVA組IL-1βmRNA表達(dá)量均明顯降低(P＜0.01)。 8、N組、A組、AA組大鼠肝組織IL-6mRNA表達(dá)量較低。AV組染菌后2h、6h、12h、24h的大鼠肝組織IL-6mRNA表達(dá)量均明顯高于N組(P＜0.05或P＜0.01)，染菌后6h、12h、24h的大鼠肝組織IL-6mRNA表達(dá)量均明顯高于

12、A組(P＜0.05或P＜0.01)，以染菌后24h為最高。AVA組染菌后6h、12h肝組織IL-6mRNA表達(dá)量仍明顯高于N組及AA組(P＜0.05或P＜0.01)，后逐漸降低。與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的AV組相比，染菌后24h時(shí)的AVA組IL-6mRNA表達(dá)量明顯降低(P＜0.01)。 9、N組、A組、AA組大鼠肝組織IL-10mRNA表達(dá)量較低。AV組染菌后12h、24h的大鼠肝組織IL-10mRNA表達(dá)量均明顯高于N組與A組(p＜0.

13、05)，以染菌后24h為最高。AVA組染菌后6h、12h、24h肝組織IL-10mRNA表達(dá)量仍明顯高于N組及AA組(p＜0.05或p＜0.01)，后逐漸降低。與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的AV組相比，染菌后24h時(shí)的AVA組IL-10mRNA表達(dá)量明顯降低(P＜0.01)。 結(jié)論： 1.酒精性肝病創(chuàng)傷弧菌膿毒癥大鼠肝組織TLR2、TLR4、MD-2mRNA表達(dá)量在膿毒癥早期即明顯升高，后期有所下降。酒精性肝病創(chuàng)傷弧菌膿毒癥早期大鼠肝組

14、織TNF-α、IL-1βmRNA表達(dá)量明顯升高，膿毒癥早中期肝組織IL-6mRNA表達(dá)量增多，膿毒癥中后期肝組織IL-10mRNA表達(dá)量逐漸增多。 2.及早使用頭孢哌酮鈉和乳酸左旋氧氟沙星可明顯減低酒精性肝病創(chuàng)傷弧菌膿毒癥大鼠肝組織TLR2、TLR4、MD-2、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10mRNA表達(dá)水平，有利于機(jī)體致炎/抗炎平衡恢復(fù)。 3.組織Toll樣受體及其配體表達(dá)上調(diào)可能通過(guò)Toll樣受體介導(dǎo)的炎