苦參生物堿對(duì)K562細(xì)胞丙酮酸激酶的作用研究.pdf

1、簡(jiǎn)述中藥苦參味苦性寒，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，主要含苦參堿和氧化苦參堿等生物堿，常被中醫(yī)臨床組方于清熱解毒方中用于腫瘤治療。當(dāng)前關(guān)于苦參堿抗白血病機(jī)制的研究主要集中在抑制增殖、誘導(dǎo)分化和凋亡，及逆轉(zhuǎn)耐藥等方面，而對(duì)細(xì)胞活動(dòng)最基本要素—物質(zhì)和能量代謝方面作用的研究則很少見(jiàn)于報(bào)道。細(xì)胞通過(guò)物質(zhì)代謝獲取能量支撐生命活動(dòng)，腫瘤細(xì)胞增殖旺盛，需增強(qiáng)糖代謝以獲取更多的能量，因此靶向抑制腫瘤細(xì)胞旺盛的物質(zhì)和能量代謝是目前研究腫瘤治療的選項(xiàng)之一。本研究以

2、白血病K562細(xì)胞為研究模型，從抗癌藥物靶向作用腫瘤細(xì)胞物質(zhì)和能量代謝的角度，探討苦參中主要生物堿抗白血病的作用機(jī)制。
　　 研究目的:本研究旨在從糖代謝的角度選取糖酵解關(guān)鍵酶丙酮酸激酶(pyruvatekinase，PK)作為抑制腫瘤增殖的靶點(diǎn)，探討苦參及所含主要生物堿苦參堿、氧化苦參堿，或苦參堿聯(lián)合氧化苦參堿抑制白血病細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡等可能機(jī)制。
　　 研究?jī)?nèi)容：首先通過(guò)建立高效液相色譜方法，測(cè)定苦參堿作用白血病細(xì)

3、胞后在細(xì)胞培養(yǎng)體系中的含量分布，以便為后續(xù)研究提供苦參堿作用濃度和時(shí)間的依據(jù)。將苦參液、苦參總堿、苦參堿、氧化苦參堿，或苦參堿聯(lián)合氧化苦參堿作用白血病K562細(xì)胞，通過(guò)丙酮酸激酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)，了解各藥物組是否可抑制丙酮酸激酶的活性，以探明各實(shí)驗(yàn)組是否通過(guò)抑制K562細(xì)胞丙酮酸激酶的活性從而阻斷糖酵解途徑，達(dá)到抑制增殖的作用。最后通過(guò)測(cè)定糖酵解代謝終產(chǎn)物乳酸生成情況進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:1. 使用HPLC 建立苦參

4、堿濃度與檢測(cè)峰面積對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的K562 細(xì)胞，加入苦參堿并調(diào)整其濃度分別為400μg/mL、200μg/mL 作用培養(yǎng)細(xì)胞，按不同時(shí)間點(diǎn)分別收集培養(yǎng)液和細(xì)胞，并裂解細(xì)胞，用HPLC 法測(cè)定培養(yǎng)基和細(xì)胞裂解液（即細(xì)胞內(nèi)）的苦參堿含量。
　　 2. 利用丙酮酸激酶活性測(cè)定試劑盒測(cè)定苦參堿、氧化苦參堿、苦參堿聯(lián)合氧化苦參堿各實(shí)驗(yàn)組先作用K562 細(xì)胞一定時(shí)間后，再裂解細(xì)胞，并測(cè)定細(xì)胞裂解液中丙酮酸激酶的活性。取對(duì)

5、數(shù)生長(zhǎng)期K562 細(xì)胞分別加入苦參堿、氧化苦參堿，并調(diào)整其濃度分別為400μg/mL和200μg/mL，苦參堿聯(lián)合氧化苦參堿實(shí)驗(yàn)組為苦參堿和氧化苦參堿各自按400μ
　　 g/mL和200μg/mL 等比例加入細(xì)胞培養(yǎng)體系，培養(yǎng)3天。然后換入新鮮培養(yǎng)基，調(diào)整培養(yǎng)體系中的藥物濃度與上述一致，繼續(xù)培養(yǎng)3天（簡(jiǎn)稱3+3 組），或繼續(xù)培養(yǎng)4天（簡(jiǎn)稱3+4 組），取出細(xì)胞裂解。按試劑盒操作方法，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定并計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組對(duì)丙酮酸激

6、酶的活性的影響。每組均設(shè)置陰性對(duì)照，且每組都重復(fù)培養(yǎng)、測(cè)定三次。
　　 3. 利用丙酮酸激酶活性測(cè)定試劑盒直接測(cè)定細(xì)胞裂解液中丙酮酸激酶的活性。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562 細(xì)胞，先裂解細(xì)胞，在酶活性測(cè)定體系中先分別加入適當(dāng)濃度的苦參提取液（簡(jiǎn)稱苦參液）、苦參總堿、苦參堿、氧化苦參堿，及苦參堿等比例濃度聯(lián)合氧化苦參堿等藥物，再在各實(shí)驗(yàn)組加入含丙酮酸激酶的K562 細(xì)胞裂解液，按前述同樣的方法測(cè)定裂解液中丙酮酸激酶的活性。每組均設(shè)置陰性

7、對(duì)照組，且每組測(cè)定三次。
　　 4. 利用HPLC 建立測(cè)定培養(yǎng)液中乳酸濃度。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562 細(xì)胞，加入苦參堿和氧化苦參堿，使其終濃度分別為400μg/mL、200μg/mL，然后培養(yǎng)3天。取培養(yǎng)基測(cè)定其中的乳酸濃度，培養(yǎng)瓶換入新鮮的培養(yǎng)基并重新調(diào)整相應(yīng)的藥物濃度與更換前相同，相同條件再次培養(yǎng)24、48h、72 小時(shí)，取出培養(yǎng)基并利用HPLC 測(cè)定其中乳酸濃度。每組均設(shè)置陰性對(duì)照，且每組都重復(fù)培養(yǎng)測(cè)定三次。
　　

8、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1. 培養(yǎng)體系中苦參堿濃度分布：苦參堿作用于K562 細(xì)胞后，培養(yǎng)基中的苦參堿含量下降，200μg/mL 苦參堿處理組下降至190μg/mL 左右，400μg/mL 苦參堿處理組下降至390μg/mL 附近，大約24 小時(shí)后趨于穩(wěn)定。與對(duì)照組比較，200μg/mL 或400μg/mL 苦參堿處理的K562 細(xì)胞裂解液（細(xì)胞內(nèi)）的苦參堿有所升高。
　　 2. 實(shí)驗(yàn)組藥物先作用K562 細(xì)胞，再裂解細(xì)胞測(cè)定其丙酮酸激酶活

9、性：分別為200μ
　　 g/mL、400μg/mL 苦參堿、氧化苦參堿，及分別為200μg/mL、400μg/mL的苦參堿聯(lián)合氧化苦參堿作用K562 細(xì)胞，其丙酮酸激酶的活性抑制率分別為：(1)苦參堿(3+3 組)0.56±0.97%（200μg/mL）、2.66±2.31%（400μg/mL）；(3+4 組)2.73±2.74%（200μg/mL）、4.06±2.00%（400μg/mL）；(2)氧化苦參堿(3+3 組)1.

10、35±0.66%（200μg/mL）、3.11±1.30%（400μg/mL）；(3+4 組)1.56±0.73%（200μg/mL）、4.31±2.47%（400μg/mL）；
　　 （3)苦參堿聯(lián)合氧化苦參堿(3+3 組)10.85±3.76%（200μg/mL）、39.96±2.28%（400μ
　　 g/mL）；(3+4 組)17.00±2.87%（200μg/mL）、47.78±2.42%（400μg/mL）。

11、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，苦參堿聯(lián)合氧化苦參堿組對(duì)K562 細(xì)胞內(nèi)丙酮酸激酶活性抑制明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01)。
　　 3. 實(shí)驗(yàn)組藥物直接作用細(xì)胞裂解液的丙酮酸激酶活性測(cè)定：苦參液和苦參總堿對(duì)K562 細(xì)胞裂解后的裂解液中丙酮酸激酶活性抑制率隨藥物濃度的增加而增加，苦參液和苦參總堿濃度分別從0.4mg/mL 增加到2.0mg/mL的過(guò)程中，抑制率分別從21.64%、43.57%上升到88.07%和94.10%,對(duì)K56

12、2 細(xì)胞裂解液丙酮酸激酶活性有抑制作用（P<0.01)，并呈濃度依賴性。而在上述濃度下，苦參堿、氧化苦參堿、等比例的苦參堿聯(lián)合氧化苦參堿等實(shí)驗(yàn)組對(duì)K562 細(xì)胞裂解液丙酮酸激酶活性的抑制并未隨藥物濃度的增加而增加，只在2.18%到17.56%這個(gè)很小的范圍內(nèi)波動(dòng),對(duì)K562 細(xì)胞裂解液丙酮酸激酶活性無(wú)抑制作用。
　　 4.苦參堿聯(lián)合氧化苦參堿組對(duì)K562細(xì)胞乳酸生成影響：無(wú)論是對(duì)照組還是苦參堿聯(lián)合氧化苦參堿處理組，乳酸產(chǎn)量都在3

13、.2μg/104個(gè)細(xì)胞/mL左右波動(dòng)。與對(duì)照組比較，分別為200μg/mL和400μg/mL的苦參堿等比例聯(lián)合氧化苦參堿對(duì)K562細(xì)胞乳酸生成的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.74)。苦參液和苦參總堿實(shí)驗(yàn)組對(duì)K562細(xì)胞乳酸生成的影響，因儀器設(shè)備問(wèn)題未做進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　 小結(jié):①一定濃度苦參堿作用于K562細(xì)胞后，培養(yǎng)基中的苦參堿含量下降，大約24小時(shí)后趨于平穩(wěn)，苦參堿在細(xì)胞中的濃度有所升高，提示培養(yǎng)基中苦參堿作用K562細(xì)胞一定時(shí)

14、間后可能進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用。②無(wú)論200μg/mL、400μg/mL的苦參堿或氧化苦參堿分別單獨(dú)先加入培養(yǎng)體系中，作用K562細(xì)胞一定時(shí)間再裂解細(xì)胞，測(cè)定丙酮酸激酶活性，還是先收集裂解K562細(xì)胞，再將上述濃度的苦參堿或氧化苦參堿直接作用裂解液中的丙酮酸激酶，測(cè)定丙酮酸激酶活性，結(jié)果顯示二者均不能抑制丙酮酸激酶活性，提示單獨(dú)使用苦參堿或氧化苦參堿對(duì)K562細(xì)胞丙酮酸激酶活性無(wú)間接或直接作用。③200μg/mL或400μg/mL苦參堿等比例

15、聯(lián)合氧化苦參堿加入培養(yǎng)基作用K562細(xì)胞一定時(shí)間后，收集并裂解細(xì)胞，再測(cè)定其丙酮酸激酶活性，發(fā)現(xiàn)可顯著抑制丙酮酸激酶活性。但將苦參堿聯(lián)合氧化苦參堿加入已經(jīng)裂解含丙酮酸激酶的K562細(xì)胞裂解液中，測(cè)定丙酮酸激酶活性，發(fā)現(xiàn)其對(duì)裂解液丙酮酸激酶活性無(wú)抑制作用。提示苦參堿聯(lián)合氧化苦參堿對(duì)丙酮酸激酶活性影響可能主要通過(guò)K562細(xì)胞間接發(fā)揮抑制作用，而對(duì)裂解液中丙酮酸激酶活性無(wú)直接的作用。④實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)苦參液、苦參總堿在實(shí)驗(yàn)濃度下均可直接抑制K562細(xì)