海島棉CKX和PG家族基因的克隆及功能分析.pdf

1、我國棉纖維品質(zhì)大都偏低，不能滿足市場需要;而棉纖維品質(zhì)主要由植物本身基因型決定，所以研究纖維發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)控對改良纖維品質(zhì)具有重要意義。
　　黃萎病是棉花最具毀滅性的病害之一，已經(jīng)嚴(yán)重影響到棉花生產(chǎn)。目前有效防治措施是篩選抗病基因和培育轉(zhuǎn)基因抗病品種。因此，深入理解棉花的抗黃萎病機(jī)制，克隆抗黃萎病相關(guān)基因并驗(yàn)證功能，對培育抗病品種具有重要意義。
　　細(xì)胞分裂素CTK是一類重要的植物激素，在調(diào)控植物生長發(fā)育和抗病性方面

2、的作用均非常重要。細(xì)胞分裂素脫氫酶CKX是目前已知的唯一能夠催化天然CTK發(fā)生不可逆降解的酶，是降解內(nèi)源CTK的關(guān)鍵因子。已有研究證明CKX能夠影響棉纖維發(fā)育和棉纖維產(chǎn)量，并參與植物的脅迫調(diào)控。
　　多聚半乳糖醛酸酶PG與細(xì)胞發(fā)育、花粉管伸長、花粉粒成熟、木質(zhì)部細(xì)胞形成等有關(guān)，還與病原菌防御、植物寄主互作相關(guān)。已有研究證明，PG與棉花花粉發(fā)育和纖維發(fā)育有關(guān)，也參與了植物抗病反應(yīng)過程。
　　本研究從課題組前期構(gòu)建的黃萎病菌誘導(dǎo)

3、下的海島棉全長cDNA文庫中，篩選出2個細(xì)胞分裂素脫氫酶家族的基因GbCKX1、GbCKX2和5個多聚半乳糖醛酸酶家族的基因GbPG2、GbPG3、GbPG4、GbPG5、GbPG6，對這些基因進(jìn)行克隆、生物信息學(xué)分析和表達(dá)模式分析預(yù)測基因的功能，并對GbCKX1和GbCKX2進(jìn)行沉默后的基因功能研究。主要結(jié)果如下:
　　1.GbCKX1和GbCKX2的克隆、表達(dá)分析和功能研究
　　(1) GbCKX1的ORF長度為1560

4、bp，編碼519個氨基酸;GbCKX2的ORF長度為1539bp，編碼512個氨基酸。多重序列分析表明，二者所編碼的蛋白同源性為80％，均屬于CKX基因家族蛋白，均含有CKX家族高度保守的FAD結(jié)合域和細(xì)胞分裂素結(jié)合域;但二者在結(jié)構(gòu)域上有所不同，GbCKX2含有L-半乳糖內(nèi)酯脫氫酶功能域(PLN02465)、D-乳酸脫氫酶功能域(PLN02805)以及蛋白質(zhì)互作基序位點(diǎn)PAS。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，GbCKX1和GbCKX2都沒有信號肽和

5、跨膜域，均屬于非分泌蛋白。同源進(jìn)化樹分析表明，基因GbCKX1、GbCKX2與植物TcCKX、PtCKX1、AtCKX7基因編碼蛋白的同源性較高，聚為一類。
　　(2)棉纖維不同發(fā)育時期的qRT-PCR結(jié)果表明，CKX1和CKX2在Pima90-53和中棉所8號呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式。CKX1在次生壁加厚期存在表達(dá)高峰，并且在Pima90-53的表達(dá)量顯著高于中棉所8號;CKX2在纖維伸長期存在表達(dá)高峰，并且在中棉所8號中的表達(dá)量顯著

6、高于Pima90-53。因此預(yù)測CKX1可能通過參與次生壁加厚期纖維的發(fā)育，影響棉纖維的強(qiáng)度;CKX2可能通過參與纖維的伸長，影響棉纖維的長度。
　　(3)黃萎病菌脅迫下的qRT-PCR結(jié)果表明，黃萎病菌脅迫后，兩個基因的表達(dá)量與對照相比均有所上升。CKX1在抗病品種Pima90-53中，12hpi表達(dá)量顯著高于對照，而在感病品種中棉所8號中，表達(dá)量顯著高于對照且出現(xiàn)在24hpi;CKX2在Pima90-53中，一開始表達(dá)量就顯著

7、高于對照，并持續(xù)到24hpi，而在中棉所8號中，黃萎病菌脅迫下的表達(dá)量與對照的表達(dá)量差異不顯著。
　　(4)利用帶有纖維種皮特異啟動子FBP7的表達(dá)載體pBI121-FBP7，成功構(gòu)建真核超表達(dá)載體pBI121-FBP7-GbCKX1和pBI121-FBP7-GbCKX2。
　　(5)成功構(gòu)建CKX1和CKX2的VIGS表達(dá)載體并在棉花抗病品種中沉默基因。結(jié)果表明，接種黃萎病菌后20d，CKX1沉默組發(fā)病比對照組嚴(yán)重，棉苗病

8、情指數(shù)顯著高于對照組;CKX2沉默后，棉苗發(fā)病情況比對照組嚴(yán)重。
　　2.多聚半乳糖醛酸酶家族基因的克隆與表達(dá)分析
　　(1)從Pima90-53中克隆得到GbPG2、GbPG3、GbPG4的ORF長度依次為1425bp、1449bp、1449bp，各編碼474、482、482個氨基酸;利用在線Blast預(yù)測GbPG5、GbPG6的ORF長度分別為1449bp、1185bp，各編碼482、394個氨基酸。
　　(2)生

9、物信息學(xué)分析表明，GbPG2沒有信號肽和跨膜域，屬于非分泌蛋白;GbPG3、GbPG5不含信號肽，但均含有一個跨膜域，推測可能屬于信號錨定蛋白;GbPG4、GbPG6都含有信號肽和一個跨膜域，推測可能屬于跨膜蛋白。
　　(3)保守域分析表明，GbPG2、GbPG3、GbPG4、GbPG5、GbPG6均屬于PG基因家族。多重序列分析表明，在植物PG家族所特有的4個結(jié)構(gòu)域Ⅰ(SPNTDG)、Ⅱ(GDDC)、Ⅲ(CGPGHGISIGSL

10、G)、Ⅳ(RIK)中，GbPG2、GbPG3、GbPG4、GbPG5包含有Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ三個結(jié)構(gòu)域，而結(jié)構(gòu)域Ⅲ的位置不同程度的被其他氨基酸所取代，GbPG6含有上述四個結(jié)構(gòu)域。同源進(jìn)化樹分析表明，基因GbPG5和已報(bào)道的棉花PG基因編碼的蛋白聚類到同一分支內(nèi)，而基因GbPG2、GbPG3、GbPG4、GbPG6編碼的蛋白則聚類到另一分支內(nèi)，分屬于不同的亞家族。
　　(4)棉纖維不同發(fā)育時期的qRT-PCR結(jié)果表明，棉纖維發(fā)育的伸長期，

11、PG4、PG6在Pima90-53和中棉所8號的表達(dá)量有顯著差異;棉纖維發(fā)育次生壁加厚期，PG2、PG5、PG6在Pima90-53中的表達(dá)量顯著高于中棉所8號;PG3在兩個品種中表達(dá)水平的差異主要出現(xiàn)在次生壁加厚期。因此預(yù)測PG4可能通過參與纖維的伸長，影響棉纖維的長度;PG2、PG3、PG5可能通過參與次生壁加厚期纖維的發(fā)育，影響棉纖維的強(qiáng)度;而PG6可能同時在伸長期和次生壁加厚期發(fā)揮作用，既影響棉纖維的長度，又影響棉纖維的強(qiáng)度。<