海島棉抗黃萎病基因GbRvd的克隆及抗病功能分析.pdf

1、棉花黃萎病主要是由大麗輪枝菌引起的土傳維管束病害，嚴(yán)重制約我國棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)，因此棉花抗黃萎病的遺傳改良和抗黃萎病機制研究是抗病育種的關(guān)鍵。本研究以本課題組構(gòu)建的黃萎病菌脅迫下的海島棉Pima90-53全長cDNA文庫為基礎(chǔ)，篩選得到一個抗黃萎病相關(guān)的EST序列。然后，利用電子克隆和RACE技術(shù)獲得一個CC-NBS-LRR家族基因，命名為GbRvd。對此基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析、黃萎病誘導(dǎo)下表達(dá)差異分析以及基因在Pima90-53中沉默

2、后抗病功能分析和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分析，得到以下結(jié)果:
　　1、GbRvd cDNA序列全長3486 bp，包括88 bp的5'非翻譯區(qū)，470 bp的3'非翻譯區(qū)和2928 bp的開放閱讀框，編碼975個氨基酸殘基，預(yù)測其分子量為112.6 kD，理論等電點為6.51;GbRvd的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示其包含2.36％β-折疊、57.95％α-螺旋、30.56％無規(guī)則卷曲和9.13％延伸鏈;GbRvd含有植物抗病基因產(chǎn)物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能域(NB

3、-ARC)、亮氨酸蛋白激酶功能域(Smc)、ATPase結(jié)合功能域(PLNOO113)及抗假單胞桿菌識別HOPA1的功能域(PLN3210)，預(yù)測為真菌效應(yīng)子識別蛋白;此外，跨膜結(jié)構(gòu)域分析表明該蛋白含有三個跨膜結(jié)構(gòu)域，無信號肽，定位于葉綠體膜。
　　2、黃萎病菌脅迫下GbRvd在不同抗、感棉花品種中的表達(dá)差異分析表明，該基因在海島棉Pima90-53中表達(dá)量顯著高于其他三個陸地棉品種，而在不同抗、感陸地棉品種間的表達(dá)差異不顯著。受

4、黃萎病菌脅迫，GbRvd在海島棉Pima90-53根莖葉中存在組織特異性表達(dá)，具體表現(xiàn)為在中的表達(dá)量顯著高于根和莖。
　　3、構(gòu)建了GbRvd的VIGS沉默載體，在Pima90-53沉默GbRvd后接種黃萎病菌，15d和20d調(diào)查病情指數(shù)和測定葉綠素含量，結(jié)果表明GbRvd沉默后，Pima90-53的病情指數(shù)顯著升高、葉綠素含量顯著降低。
　　4、在GbRvd沉默以后，黃萎病菌誘導(dǎo)植株P(guān)R5基因的表達(dá)顯著升高，而PR4和ED