海島棉抗黃萎病相關(guān)基因GbLOX和GbAOS的克隆與功能鑒定.pdf

1、棉花黃萎病是由大麗輪枝菌引起的土傳維管束病害，嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量和纖維品質(zhì)，因此抗黃萎病機(jī)制研究是棉花種質(zhì)創(chuàng)新所要解決的關(guān)鍵問題之一。前人已報(bào)導(dǎo)LOX和AOS參與了植物的抗病反應(yīng)，本研究以課題組構(gòu)建的黃萎病菌脅迫下海島棉Pima90-53根組織全長cDNA文庫為基礎(chǔ)，篩選得到11個(gè)LOX和AOS的EST序列。通過同源克隆和RT-PCR技術(shù)克隆得到了其對(duì)應(yīng)的基因，分別命名為Gb9-LOX、Gb13-LOX、GbAOS1和GbAOS2。主要

2、研究內(nèi)容包括:基因克隆和生物信息學(xué)分析，啟動(dòng)子克隆與調(diào)控序列分析，黃萎病誘導(dǎo)和外源激素處理下的基因表達(dá)分析，以及利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默(Virus-induced gene silencing)鑒定基因抗黃萎病功能。
　　本研究主要獲得以下結(jié)果:
　　1.通過同源克隆和RT-PCR技術(shù)，從海島棉克隆獲得2個(gè)編碼脂氧合酶的基因—Gb9-LOX和Gb13-LOX，以及2個(gè)編碼丙二烯氧化物合酶的基因—GbAOS1和GbAOS2，它

3、們的ORF分別為2598 bp、2616 bp、1491 bp、1572 bp。
　　2.生物信息學(xué)分析表明，Gb9-LOX和Gb13-LOX都含有PLAT LH2和Lipoxygenase活性位點(diǎn)，但Gb9-LOX編碼蛋白為9-脂氧合酶，而Gb13-LOX編碼蛋白為13-脂氧合酶:GbAOS1和GbAOS2都含有PLN02648活性位點(diǎn)，屬于P450家族成員;這4個(gè)基因編碼蛋白均預(yù)測(cè)為可溶性蛋白，且無跨膜域和信號(hào)肽。
　　

4、3.從海島棉Pima90-53中克隆得到Gb9-LOX和GbAOS1的啟動(dòng)子，長度分別為1067 bp和1212 bp。生物信息學(xué)分析表明，Gb9-LOX的啟動(dòng)子中含有響應(yīng)生長素、乙烯、水楊酸、防御反應(yīng)和類黃酮合成相關(guān)的MYB結(jié)合位點(diǎn)的順式作用元件;GbAOS1的啟動(dòng)子中含有響應(yīng)茉莉酸、水楊酸、乙烯、赤霉素、機(jī)械創(chuàng)傷、干旱和參與植物防御反應(yīng)的順式作用元件。
　　4.利用qRT-PCR技術(shù)分析黃萎病誘導(dǎo)下和外源激素處理下基因的表達(dá)差

5、異，發(fā)現(xiàn)Gb9-LO、Gb13-LOX、GbAOS1、GbAOS2均能受黃萎病菌和茉莉酸甲酯誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá);Gb13-LOX、GbAOS1可受水楊酸誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，而Gb13-LOX、GbAOS1的表達(dá)量不受乙烯的影響，Gb9-LO、GbAOS2可受水楊酸和乙烯誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)。
　　5.組織特異性表達(dá)分析顯示，Gb9-LOX、Gb13-LOX、GbAOS1、GbAOS2在根、莖和葉中均有表達(dá)，但Gb9-LOX、Gb13-LOX、GbAO