海島棉乙烯響應(yīng)因子GbERF1-like在抗黃萎病反應(yīng)中的功能解析.pdf

1、棉花黃萎病是影響棉花生產(chǎn)的主要病害，乙烯信號路徑在棉花與黃萎病菌的互作中扮演著重要的角色。明確乙烯在棉花抗黃萎病反應(yīng)中的調(diào)節(jié)機(jī)制，并調(diào)控乙烯信號路徑來改良棉花的抗病性對棉花抗病育種和生產(chǎn)具有重要意義。本研究從海島棉品種“7124”中克隆了乙烯信號路徑的一個ERFs類轉(zhuǎn)錄因子基因GbERF1-like，并對其在棉花抗黃萎病反應(yīng)中的作用機(jī)制開展了研究，取得的主要結(jié)果有:
　　1、克隆了GbERF1-like的全長序列，其ORF框為53

2、7 bp，編碼179個氨基酸的多肽，含有一個59個氨基酸的ERFs類轉(zhuǎn)錄因子保守AP2/ERF結(jié)構(gòu)域。序列聚類顯示GbERF1-like與GhERF1(AY181251.1),GhERF8(JN656957.1),TbERF(XM_007035031.1)，GbERF5(JN003808.1)和AtERF1(AB008103)具有較高的同源性。表達(dá)分析顯示GbERF1-like在棉花的不同組織都有表達(dá)，并能快速響應(yīng)ET、MeJA處理。相

3、對于感病的陸地棉，GbERF1-like在抗病的海島棉接種黃萎病菌“V991”后上調(diào)表達(dá)迅速，并且持續(xù)的時間長。
　　2、通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化獲得了GbERF1-like在棉花中的超量表達(dá)系COV20、COV5與抑制表達(dá)系Ci8、Ci6，以及GbERF1-like在擬南芥中的超量表達(dá)純系A(chǔ)OV12、AOV5。接種鑒定分析表明，GbERF1-like的超量表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因棉花和擬南芥的抗病性，而抑制GbERF1-like表達(dá)的轉(zhuǎn)

4、基因棉花抗病性降低?；虮磉_(dá)分析表明GbERF1-like在棉花中能正調(diào)控PR3、PR4的表達(dá)，負(fù)調(diào)控PR1、PR5的表達(dá)。但在擬南芥中GbERF1-like能促進(jìn)AtPR3、AtPR4及AtPDF1.2的表達(dá)，但抑制AtPR2的表達(dá)。此外，表達(dá)分析還顯示木質(zhì)素合成路徑相關(guān)基因表達(dá)受GbERF1-like表達(dá)水平的影響，GhPAL5、GhC4H1、GhC3H1、GhHCT1、GhCCoAOMT1和GhF5H2等基因在GbERF1-lik

5、e超量表達(dá)棉花中表達(dá)上升，而在其抑制轉(zhuǎn)基因系中表達(dá)量下降。類似的結(jié)果在擬南芥中也有發(fā)現(xiàn)，這暗示GbERF1-like可能在植物中參與木質(zhì)素合成的調(diào)控。此外，與Mock相比，接種黃萎病菌后GbERF1-like超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因棉花、擬南芥中木質(zhì)素合成路徑相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)更為顯著。
　　用Wiesner方法對棉花莖的木質(zhì)素染色結(jié)果顯示，Mock處理及“V991”處理后的各棉花材料均可被染為紅色，所有接種處理的著色明顯比Mock深。在

6、Mock處理的各材料間，GbERF1-like超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因棉花染色最深，而GbERF1-like抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因棉花染色最淺。木質(zhì)素總量測定與染色結(jié)果相符，接菌處理后，WT、轉(zhuǎn)基因系莖的木質(zhì)素總量均比Mock處理對應(yīng)材料顯著增加。在Mock及“V991”接種處理后，GbERF1-like超量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因棉花、擬南芥中木質(zhì)素總量分別比WT增加6.9％-44.3％，而抑制GbERF1-like表達(dá)的轉(zhuǎn)基因棉花中木質(zhì)素總量比WT降低13.

7、2％-23.4％。木質(zhì)素單體測定表明，與Mock相比，各材料的G和S單體在接菌后都增加。在Mock及“V991”接種處理后，棉花G單體含量在超表達(dá)材料中比WT高但沒有達(dá)到顯著水平，RNAi系的G單體含量比WT顯著降低，在5.9％-12.4％之間。轉(zhuǎn)基因擬南芥與WT相比，G單體含量增加幅度在11.2％-31.6％之間。各棉花材料的S單體含量在兩種處理中，超表達(dá)材料含量較野生型增加10.8％-33.6％，而抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因系下降，降低了7.

8、4％-12.9％。擬南芥的S單體增加不明顯。
　　3、分析顯示GhHCT1和AtPAL3兩個基因的啟動子序列均含有TAAT-box、CAAT-box及GCCGCC-box的ERF類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合順式元件。利用酵母單雜交分析表明GbERF1-like與GhHCT1和AtPAL3的啟動子之間存在互作。利用雙分子熒光檢測進(jìn)一步證實GbERF1-like在棉花原生質(zhì)體中可以結(jié)合GhHCT1和AtPAL3基因的啟動子，并提高這兩個木質(zhì)素合成關(guān)

9、鍵基因的轉(zhuǎn)錄活性。以上結(jié)果證明GbERF1-like直接參與了棉花及擬南芥的木質(zhì)素合成調(diào)控。
　　4、為了進(jìn)一步證明GbERF1-like介導(dǎo)的棉花抗黃萎病增強(qiáng)與木質(zhì)素合成激活有關(guān)，我們利用病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)對GbERF1-like超量表達(dá)棉花材料COV20中的GhHCT1進(jìn)行了抑制。分子檢測、接種鑒定及木質(zhì)素含量測定表明，在抑制GhHCT1表達(dá)后，GbERF1-like超量表達(dá)棉花材料的抗病性明顯降低，其莖部木質(zhì)素含量減少。

10、同時木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達(dá)均受到影響，木質(zhì)素合成上游基因，如GhPAL1(Gbscaffold40957.1)、 GhPAL5(Gbscaffold11559.9)、 GhC4H（Gbscaffold12103.1）普遍表現(xiàn)為表達(dá)量降低，而木質(zhì)素合成下游的基因則普遍表現(xiàn)為表達(dá)水平上升，如GhCCR（Gbscaffold2152.13），GhCAD(Gorai.009G192400.1)，GhF5H（Gbscaffold12698.2）

11、和GhCOMT(Gorai.004G125600.1)。以上結(jié)果證明木質(zhì)素合成增強(qiáng)在GbERF1-like介導(dǎo)的棉花抗黃萎病反應(yīng)中具有重要作用。
　　5、通過酵母雙雜交篩選鑒定到部分與GbERF1-like互作的蛋白因子。部分因子為前期已報道參與棉花抗病反應(yīng)的蛋白，如MAPK, MLP, DIRIGENT(Cai et al.，2014;Yang et al.，2015; Hosmani et al.，2013)。此外也有部分互作