海島棉GbPDF2基因的克隆及功能分析.pdf

1、棉花是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一,棉纖維是紡織工業(yè)的重要原料。棉纖維是由種子表皮細(xì)胞生長而來,了解其發(fā)育分子機(jī)理有助于在分子水平上調(diào)控纖維的產(chǎn)量與品質(zhì)。PDF2基因是HD-ZIP IV家族中一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,而該家族基因成員在擬南芥中主要參與根毛的發(fā)育和表皮細(xì)胞的分化,同時(shí)調(diào)節(jié)花色素苷的積累和毛狀體形成等。因此本研究采用同源克隆的方法,以亞洲棉品種亞洲棉3號(hào)(HD1基因突變體)和4號(hào)(HD1基因正常)、海島棉和陸地棉品種TM-1為實(shí)驗(yàn)

2、材料,分析PDF2基因在棉纖維起始分化發(fā)育分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用。
　　1、采用同源克隆的方法從海島棉中分別克隆到PDF2基因的A亞組和D亞組全長 DNA序列,BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn) PDF2基因含有10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子;用DNAMAN7分析發(fā)現(xiàn)A亞組全長基因可翻譯出744個(gè)氨基酸;D亞組全長基因可翻譯為734個(gè)氨基酸;海島棉的A亞組和D亞組的堿基序列存在很大的差異,即與D亞組相比,從ATG開始,A亞組在80bp處有6個(gè)堿基的缺失,

3、在693bp處有36個(gè)堿基的插入。PDF2基因含有 HD-ZIP IV家族中最典型的2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,即Homeobox domain和START domain。進(jìn)化分析表明GbPDF2基因的起源時(shí)間與擬南芥、葡萄的起源時(shí)間最為接近,即與擬南芥、葡萄的進(jìn)化時(shí)間相近,親緣關(guān)系最近。在棉花中ATML1的同源基因GhHD1和GbPDF2基因的進(jìn)化起源時(shí)間則相差較遠(yuǎn),這兩個(gè)基因的堿基序列間的變異較大,功能變異可能較大。進(jìn)化樹又可分為兩個(gè)小的分支,

4、即單子葉植物水稻、高粱、二穗短柄草和玉米聚為一類,其他的雙子葉植物聚為一類。
　　2、利用RT-PCR和Real-time PCR技術(shù)初步研究了該基因在棉纖維不同發(fā)育階段的表達(dá)特性。比較亞洲棉3號(hào)(HD1基因突變體)和4號(hào)(HD1基因正常)的表達(dá)量后發(fā)現(xiàn)PDF2基因在0 DPA胚珠和5 DPA胚珠中的表達(dá)量差異較大。和在亞洲棉中發(fā)現(xiàn)的一樣,在陸地棉(TM-1)和海島棉中,PDF2基因在0 DPA時(shí)期的表達(dá)量達(dá)到峰值,此后表達(dá)量隨之

5、下降,在5 DPA時(shí)期又略有上升,隨即下降。因此可初步說明PDF2基因參與調(diào)控棉纖維的起始分化發(fā)育。
　　3、利用Gateway法構(gòu)建GbPDF2-RNAi的干擾表達(dá)載體,轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101,利用花絮浸染法侵染擬南芥,得到T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥。通過電鏡和表型觀測,RNAi干擾的陽性轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的表型變化不太明顯。
　　4、利用同源克隆的方法克隆到GbPDF2基因的啟動(dòng)子,并在PLACE網(wǎng)站在線分析 GbPDF2啟動(dòng)子序

6、列,結(jié)果表明序列中含有多種典型的高等植物啟動(dòng)子順式作用元件 CAAT-BOX、GATA-BOX、TATA-BOX。此外該啟動(dòng)子還帶有參與生長素、ABA和乙烯反應(yīng),熱激蛋白的結(jié)合位點(diǎn),參與L1 layer-specific和根毛發(fā)育,WRKY蛋白的結(jié)合位點(diǎn),MYB結(jié)合位點(diǎn)等。為進(jìn)一步研究棉花GbPDF2基因的組織特異性表達(dá)特征,構(gòu)建了pCXGUS-GbPDF2表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染擬南芥后得到pCXGUS-GbPDF2的T1代轉(zhuǎn)基因植株。GUS化