海島棉microRNA及其靶標(biāo)的鑒定和功能分析.pdf

1、microRNA(miRNA)作為一類(lèi)長(zhǎng)度在21-24 nucleotide(nt)的非編碼RNA，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育，形態(tài)建成，激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，逆境脅迫響應(yīng)方面起著重要的作用。目前，miRNA在棉花領(lǐng)域的研究不多，特別是在棉花纖維發(fā)育的功能研究幾乎沒(méi)有，而棉花纖維這種單細(xì)胞類(lèi)型是研究細(xì)胞伸長(zhǎng)和細(xì)胞壁合成的良好模型。故我們利用小RNA測(cè)序和降解組測(cè)序的手段，鑒定了一批在棉花纖維中表達(dá)的miRNAs和大量的miRNA靶標(biāo)基因，并且我們利用轉(zhuǎn)基

2、因手段對(duì)miRNA157及其靶標(biāo)在纖維發(fā)育和調(diào)控花器官大小的功能做了一定的闡述。具體結(jié)果簡(jiǎn)述如下:
　　1.纖維發(fā)育相關(guān)microRNAs的挖掘與鑒定
　　我們構(gòu)建了七個(gè)纖維發(fā)育文庫(kù)，覆蓋纖維的起始，伸長(zhǎng)和次生壁加厚期。七個(gè)文庫(kù)一共檢測(cè)到了78萬(wàn)到209萬(wàn)條序列，注釋到47個(gè)保守miRNA家族，同時(shí)預(yù)測(cè)了34條保守miRNA前體。此外，還鑒定了七個(gè)新的候選miRNAs。這些小RNA的長(zhǎng)度主要集中在21nt到24nt之間，mi

3、RNA的5'首位堿基更偏好為尿嘧啶。聚類(lèi)分析和Northern blot的結(jié)果顯示大部分的miRNAs在纖維發(fā)育的不同時(shí)期變化非常劇烈。轉(zhuǎn)基因和組織化學(xué)染色的方法進(jìn)一步證明miR156/157，miR165/166和miR172在纖維和胚珠中具有生物活性。
　　2.miRNA靶標(biāo)基因調(diào)控纖維發(fā)育網(wǎng)絡(luò)的挖掘和鑒定
　　利用降解組測(cè)序的手段，共有140個(gè)保守miRNAs靶標(biāo)和38個(gè)新的候選miRNAs靶標(biāo)被檢測(cè)到。這些保守靶標(biāo)中

4、有很多是轉(zhuǎn)錄因子，還有一些跟生長(zhǎng)素信號(hào)，鈣離子信號(hào)，雙氧水信號(hào)相關(guān)。另外還發(fā)現(xiàn)許多靶標(biāo)和細(xì)胞壁、細(xì)胞骨架相關(guān)或者是能量代謝相關(guān)。RLM-RACE技術(shù)也證實(shí)了microRNA的確能夠誘導(dǎo)靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄本被剪切降解，證明降解組測(cè)序的結(jié)果是可靠的。我們挑選了七個(gè)感興趣的靶標(biāo)，分析了靶標(biāo)和對(duì)應(yīng)miRNAs表達(dá)模式的負(fù)相關(guān)性，據(jù)此推測(cè)Gb-miR156/157，390，399可能通過(guò)參與到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控來(lái)影響纖維發(fā)育，而Gb-miR159，16

5、4，167和nmiR3可能直接調(diào)控細(xì)胞骨架的合成、細(xì)胞壁的合成與修飾，以及能量代謝來(lái)調(diào)控纖維的發(fā)育。
　　3.miRNA157可能正調(diào)控纖維伸長(zhǎng)
　　分析野生種和馴化種棉花差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)miR157的靶標(biāo)SBP轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平在棉花野生種纖維細(xì)胞整體上要高于馴化種，而Gb-miR157相反地在馴化種中表達(dá)量更高。通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段，降低miR157在纖維細(xì)胞的活性，可以提高miR157靶標(biāo)SBP轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量，而轉(zhuǎn)基因材料

6、的纖維長(zhǎng)度則變短。由此推測(cè)，SBP轉(zhuǎn)錄因子可能抑制纖維細(xì)胞的發(fā)育。推測(cè)棉花馴化過(guò)程中，通過(guò)提高miR157的表達(dá)量來(lái)間接抑制SBP轉(zhuǎn)錄因子，最終達(dá)到促進(jìn)纖維伸長(zhǎng)的目的。
　　4.miRNA157參與調(diào)控花器官的發(fā)育
　　Real-time PCR和Northern blot結(jié)果顯示miR157的表達(dá)量的確在超量表達(dá)miRNA157轉(zhuǎn)基因材料中顯著提高了，但是轉(zhuǎn)基因材料的纖維長(zhǎng)度并沒(méi)有如預(yù)期的變長(zhǎng)。轉(zhuǎn)基因材料植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)特別旺

7、盛，葉枝明顯增多，而花器官相反卻明顯變小，子房?jī)?nèi)胚珠數(shù)目明顯減少，導(dǎo)致最終棉桃成熟的種子數(shù)目減少，收獲的單鈴籽棉產(chǎn)量顯著降低。利用RLM-RACE技術(shù)技術(shù)在棉花花蕾中鑒定了miR157的靶標(biāo)基因，它們是5個(gè)SBP-like(SPL)轉(zhuǎn)錄因子。利用RNA sequencing技術(shù)，我們也發(fā)現(xiàn)這5個(gè)SPLs基因的表達(dá)量在超量表達(dá)植株里面下調(diào)表達(dá)，進(jìn)一步證明miRNA157可能通過(guò)負(fù)調(diào)控這5個(gè)SPLs基因來(lái)影響花器官的發(fā)育。另外，RNA se