陸地棉體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中miRNAs及其靶標(biāo)的鑒定和GhmiR157a-GhSPL10功能分析.pdf

1、體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系是研究已分化組織和器官脫分化和再分化的良好模型，也是植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的重要依托，對(duì)于其機(jī)制的研究具有重要的理論和應(yīng)用價(jià)值。microRNAs(miRNAs)是一類長(zhǎng)度通常為19-25個(gè)核苷酸(nt)的內(nèi)源非編碼RNA，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育，激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，逆境脅迫響應(yīng)等方面起著重要的作用。然而棉花中關(guān)于miRNAs的研究較少;本研究基于實(shí)驗(yàn)室前期篩選的一個(gè)高效體細(xì)胞胚胎發(fā)生的材料YZ1，利用小RNA測(cè)序結(jié)合降解組測(cè)序，鑒定棉花

2、體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中的小RNA及其靶標(biāo)基因，研究他們?cè)隗w細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中的動(dòng)態(tài)調(diào)控，綜合闡述小RNA及其靶標(biāo)基因在棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生中的調(diào)控作用;并進(jìn)一步探討棉花中GhmiR157a及其靶標(biāo)GhSPL10在棉花脫分化過(guò)程中的生物學(xué)功能。主要研究結(jié)果如下:
　　1、棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生相關(guān)miRNAs及其靶標(biāo)基因的挖掘與鑒定
　　本研究構(gòu)建了YZ1胚性愈傷(EC)和下胚軸(CK，對(duì)照)的小RNA測(cè)序文庫(kù)。發(fā)現(xiàn)36個(gè)家族的保守m

3、iRNAs在兩個(gè)樣品間差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)屬于19個(gè)家族的29條保守miRNAs的前體，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了25個(gè)新的miRNAs及其前體。這些miRNAs的長(zhǎng)度主要集中在19nt到24 nt之間，21 nt的占了約80％。同時(shí)利用降解組測(cè)序，在EC中共發(fā)現(xiàn)234個(gè)轉(zhuǎn)錄本被23個(gè)保守miRNAs家族成員所剪切，在CK中共發(fā)現(xiàn)322個(gè)轉(zhuǎn)錄本被30個(gè)保守miRNAs家族成員所剪切，同時(shí)發(fā)現(xiàn)16個(gè)轉(zhuǎn)錄本被8個(gè)新的miRNAs所剪切。這些保守靶標(biāo)中包括轉(zhuǎn)錄因子

4、、激素信號(hào)以及逆境信號(hào)相關(guān)的基因。此外本研究還發(fā)現(xiàn)4個(gè)TAS3轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生的tasiRNAs及其靶標(biāo)AFR3/4。5'RACE技術(shù)證實(shí)大部分保守miRNA能夠誘導(dǎo)它們保守的靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄本被剪切降解，這說(shuō)明降解組測(cè)序的結(jié)果是比較可靠的。miRNA和靶標(biāo)表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，miR156及其靶標(biāo)SPL9，miR169及其靶標(biāo)NF-YA3和miR396及其靶標(biāo)GRF8在棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中具有明顯的負(fù)相關(guān)性，據(jù)此推測(cè)這些miRNAs可能通過(guò)負(fù)調(diào)控相

5、應(yīng)的靶標(biāo)進(jìn)一步調(diào)控下游信號(hào)路徑，從而參與調(diào)控陸地棉體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程。
　　2、GhmiR157a/GhSPL10參與調(diào)控棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程
　　體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)GhmiR157a及其靶標(biāo)GhSPL10在脫分化前期以及胚性再分化過(guò)程中均顯示相反的表達(dá)趨勢(shì)。進(jìn)一步通過(guò)原位雜交發(fā)現(xiàn)GhSPL10在外植體的形成層以及魚雷胚的原維管組織表達(dá)，暗示GhmiR157a和 GhSPL10可能通過(guò)調(diào)控形成層細(xì)胞分裂和分

6、化來(lái)調(diào)控體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程。通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段超表達(dá)GhmiR157a和GhSPL10，發(fā)現(xiàn)雖然超表達(dá)GhmiR157a沒(méi)有明顯表型，但是超表達(dá)GhSPL10能夠提高愈傷增殖速率(callus proliferation rate，CPR)，并且導(dǎo)致胚性再分化提前。轉(zhuǎn)基因系脫分化前期的石蠟切片顯示GhSPL10超表達(dá)造成維管束形態(tài)發(fā)生了變化，表現(xiàn)為木質(zhì)部細(xì)胞小而多，且連續(xù)分布;外植體誘導(dǎo)3d以后形成層細(xì)胞增多，并且細(xì)胞周期相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)。

7、這些結(jié)果說(shuō)明GhSPL10超量表達(dá)造成了形成層細(xì)胞分裂加快，從而提高了脫分化速率。
　　3、GhmiR157a/GhSPL10通過(guò)調(diào)控乙烯信號(hào)路徑和類黃酮生物合成路徑來(lái)調(diào)控棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生
　　為了進(jìn)一步闡釋超表達(dá)GhSPL10脫分化加快的原因，本研究對(duì)陰性對(duì)照和GhSPL10超量表達(dá)株系35S∶rSPL10-7的下胚軸進(jìn)行RNA-SEQ測(cè)序。通過(guò)對(duì)測(cè)序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn):1）GhSPL10超表達(dá)系與對(duì)照相比，有1600多個(gè)差異

8、表達(dá)的基因，其中1005個(gè)上調(diào)表達(dá)，633個(gè)下調(diào)表達(dá);2）利用差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO和KEGG分析均發(fā)現(xiàn)類黃酮生物合成路徑和植物激素信號(hào)路徑顯著富集;3）qRT-PCR驗(yàn)證了乙烯合成酶基因ACOs以及類黃酮合成相關(guān)基因在GhSPL10超表達(dá)系中均上調(diào)表達(dá);4）類黃酮含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)GhSPL10超表達(dá)系中不同種類的類黃酮與對(duì)照相比顯著增加。
　　35S∶rSPL10-7與F3H干涉系Ri3雜交F1代愈傷增殖明顯受抑制，并且在體外添加類

9、黃酮之后恢復(fù)至野生型水平。對(duì)野生型外植體進(jìn)行不同種類的類黃酮處理也能夠促進(jìn)愈傷增殖和細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)。以上結(jié)果說(shuō)明類黃酮在GhSPL10超表達(dá)系中的過(guò)量積累是造成其愈傷增殖變快的主要原因。
　　4、乙烯信號(hào)是導(dǎo)致類黃酮生物合成路徑上調(diào)的主要因素之一。
　　用乙烯合成抑制劑AVG處理35S∶rSPL10-7外植體明顯抑制其脫分化，而用乙烯前體ACC處理野生型外植體能夠促進(jìn)愈傷增殖，用乙烯合成的抑制劑AVG和CoCl2，或

10、者乙烯響應(yīng)的抑制劑Ag2S2SO3處理則抑制脫分化，說(shuō)明乙烯信號(hào)在GhSPL10超表達(dá)系中的上調(diào)對(duì)愈傷增殖起到正向作用。另外，qRT-PCR的結(jié)果顯示，ACC處理能夠進(jìn)一步激活35S∶rSPL10-7中F3H的相對(duì)表達(dá)水平，而在rSPL10-7/F3H-Ri3外植體中F3H表達(dá)受到明顯抑制，且ACC處理并不能進(jìn)一步上調(diào)其表達(dá)水平，說(shuō)明GhSPL10超表達(dá)確實(shí)造成了乙烯介導(dǎo)的類黃酮生物合成路徑的變化。另外在脫分化前期，通過(guò)ACC處理野生型