陸地棉體細(xì)胞胚分化過程中特異表達(dá)基因的研究.pdf

1、棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究對于促進(jìn)棉花遺傳工程改良具有極其重要的意義，但是對于陸地棉體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程的分子機(jī)制研究仍然較少。 本研究以中棉所24篩選出的高分化率株系W10為材料，以培養(yǎng)35天的愈傷組織cDNA為driver，胚性愈傷組織出現(xiàn)后1、2、3、4、5、6、7、14、21天的混合cDNA為tester，構(gòu)建了抑制性消減文庫。經(jīng)驗(yàn)證胚性愈傷組織中差異表達(dá)的基因片段得到了約20倍的富集，文庫滴度為1×104pfu/ml，重組

2、率99％。經(jīng)過反向Northern篩選，得到368個(gè)差異表達(dá)的ESTs，代表了254個(gè)非冗余基因。分析表明，消減文庫中含有一些參與棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生的新基因。從非冗余基因中選擇了8個(gè)基因，RT-PCR結(jié)果表明這些基因在不同時(shí)間的胚性愈傷組織中均表現(xiàn)出不同程度的上調(diào)。以再分化培養(yǎng)基(MSB培養(yǎng)基中添加0.1mg/LIAA及0.1mg/LKT)和未添加任何激素的空白對照培養(yǎng)基，取第15天和第30天的愈傷組織，以等量混合的dscDNA標(biāo)記探針

3、。經(jīng)過反向Northern篩選，共得到220個(gè)激素應(yīng)答克隆，對應(yīng)117個(gè)非冗余基因。隨后利用SSRIT軟件在254個(gè)非冗余基因中找到了19條可用于分子標(biāo)記的具有簡單重復(fù)序列的EST，在親本組配為TM-1×W10的F2群體中驗(yàn)證，其中4對引物具有多態(tài)性。利用T測驗(yàn)分析這些多態(tài)性標(biāo)記與TM-1×W10的F2群體的胚性愈傷組織分化率這一性狀之間不具有相關(guān)性，尚不能構(gòu)成單標(biāo)記。應(yīng)擴(kuò)大消減文庫的測序范圍，繼續(xù)尋找與胚性愈傷組織分化率相關(guān)的EST-