陸地棉亞紅株(Rs)侯選基因的克隆和功能分析.pdf

1、陸地棉亞紅株(Rs)基因是新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)棉花遺傳標(biāo)記基因。亞紅株棉的淡紅葉色介于經(jīng)典紅株棉和正常綠株棉之間，而開(kāi)花當(dāng)天的花瓣顏色較經(jīng)典紅株棉深。此外，相較經(jīng)典的紅株棉和正常的綠株棉，亞紅株棉的光合效率更高。明確陸地棉亞紅株突變體中花色素合成調(diào)控的關(guān)鍵基因，不僅為Rs基因的圖位克隆奠定基礎(chǔ)，還為棉花的高光效育種提供一定的理論依據(jù)。
　　前人將Rs基因初步定位于棉花A基因組的第7號(hào)染色體上，與陸地棉經(jīng)典紅株(R1)基因在D基因組第16號(hào)

2、染色體上的座位對(duì)應(yīng)。課題組前期從陸地棉經(jīng)典紅株植株中克隆了與擬南芥PAP1同源的GhPAP1D基因，并預(yù)測(cè)GhPAP1D基因是R1基因的候選基因。為探究亞紅株棉中的花色素調(diào)控基因，本研究從亞紅株棉中克隆了PAP1的同源基因，并對(duì)這些同源基因進(jìn)行了序列分析、轉(zhuǎn)基因煙草的功能驗(yàn)證和基因連鎖分析。
　　主要結(jié)果如下:
　　1.陸地棉PAP1同源基因的克隆與序列分析
　　根據(jù)D基因組中GhPAP1D對(duì)應(yīng)區(qū)段的序列，從陸地棉中克

3、隆了另外3個(gè)PAP1同源基因，分別命名為:GhPAP1A、GhPAP2A和GhPAP2D。從亞紅株棉和正常綠株棉兩種材料中克隆獲得3個(gè)PAP1同源基因的共6個(gè)cDNA序列。核苷酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，GhPAP1A基因的cDNA序列在兩種材料中存在3個(gè)堿基的差異，而GhPAP2A和GhPAP2D基因的堿基序列在兩種材料中完全一致。
　　多重序列比對(duì)表明陸地棉PAP1同源蛋白（GhPAP1A、GhPAP2A、GhPAP1D和GhPAP2D）

4、和可可、擬南芥、花椰菜等物種中的R2R3-MYB蛋白在R2R3 MYB結(jié)構(gòu)域具有高度的序列保守性。這些MYB蛋白在C端均含有一個(gè)第6 MYB亞家族(Sg6)特有的保守基序（KPRPR[T/S]）。
　　對(duì)GhPAP1A、GhPAP2A、GhPAP1D和GhPAP2D蛋白與擬南芥次生代謝調(diào)控相關(guān)的MYB亞家族成員的進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建和檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)陸地棉中這4個(gè)PAP1同源蛋白均被分到第6亞組（Sg6），說(shuō)明這4個(gè)同源基因與Sg6亞家族的M

5、YB蛋白基因在進(jìn)化上是同源的。Sg6亞家族的MYB蛋白參與植物花色素的合成調(diào)控，推測(cè)GhPAP1A、GhPAP2A、GhPAP1D和GhPAP2D蛋白均屬于Sg6亞家族的R2R3-MYB蛋白，具有調(diào)控植物花色素合成的功能。
　　2.PAP1同源基因的異位表達(dá)
　　為研究克隆的PAP1同源基因的生物學(xué)功能，構(gòu)建了4個(gè)棉花PAP1同源基因序列(GhPAP1A-Rs、GhPAP1A-G、GhPAP2A和GhPAP2D)的超量表達(dá)載

6、體并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入煙草中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種PAP1同源基因序列的超量表達(dá)均能上調(diào)花色素結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)轉(zhuǎn)基因煙草中花色素的合成和積累。以上結(jié)果表明來(lái)源于亞紅株和正常綠株的GhPAP1A基因(GhPAP1A-Rs和GhPAP1A-G)，以及GhPAP2A和GhPAP2D基因均能編碼有功能的R2R3-MYB蛋白，促進(jìn)花色素的合成。
　　3.PAP1同源基因的表達(dá)分析
　　為進(jìn)一步探究棉花PAP1同源基因和亞紅植株中花

7、色素途徑調(diào)控的關(guān)系，利用定量RT-PCR檢測(cè)了亞紅株棉中GhPAP1A、GhPAP2A、GhPAP1D和GhPAP2D基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，在亞紅株棉和綠株棉中GhPAP2A、GhPAP1D和GhPAP2D基因的表達(dá)水平均較低且無(wú)明顯差異，但是GhPAP1A基因在亞紅株棉中的表達(dá)水平有著顯著的升高且遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于在綠株棉中的表達(dá)水平。推測(cè)GhPAP1A基因可能在亞紅株棉的花色素合成中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。
　　4.GhPAP1A的啟

8、動(dòng)子研究
　　為研究GhPAP1A基因與亞紅株棉中花色素合成的關(guān)系，分別在亞紅株棉和綠株棉中克隆了GhPAP1A基因ORF上游約2.5kb的啟動(dòng)子序列(pGhPAP1A)。通過(guò)核苷酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在亞紅株棉中的pGhPAP1A比在綠株棉中多一段50bp的重復(fù)序列。利用亞紅株棉×綠株棉的F2群體檢測(cè)了重復(fù)序列與亞紅株的連鎖關(guān)系。GhPAP1A啟動(dòng)子區(qū)域的重復(fù)序列與亞紅株(Rs)基因完全連鎖，表明GhPAP1A基因是陸地棉亞紅株突變體