花生脂肪酸代謝重要基因的克隆與載體構(gòu)建.pdf

1、花生是世界四大油料作物之一，在全世界范圍內(nèi)的熱帶和亞熱帶地區(qū)廣為種植。中國(guó)是世界上花生生產(chǎn)和消費(fèi)最多的國(guó)家之一[1]，因此，提高我國(guó)花生的產(chǎn)量和油脂品質(zhì)意義重大。研究認(rèn)為，決定食用植物油脂品質(zhì)的關(guān)鍵因素是脂肪酸的構(gòu)成。長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)花生育種以高產(chǎn)為育種目標(biāo)，忽視了優(yōu)質(zhì)專用品種的選育。盡管我國(guó)生產(chǎn)的花生50％以上用于榨油，花生種質(zhì)資源中有粗脂肪含量高達(dá)61％的種質(zhì)，但高油育種至今未引起足夠的重視，從而造成生產(chǎn)上應(yīng)用的品種普遍脂肪含量不高。

2、因此提高花生種子中脂肪酸的含量是花生品質(zhì)改良的主要方向。為此，本研究應(yīng)用生物技術(shù)手段，擬對(duì)花生油脂品質(zhì)進(jìn)行改良。通過(guò)同源克隆途徑分別克隆了丙酮酸羧化酶基因(PEP)；ω-3脂肪酸脫氫酶基因(FAD3)：二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因(DGAT)的編碼區(qū)及片段。構(gòu)建了種子特異表達(dá)PEP的反義RNA植物表達(dá)載體和FAD3及DGAT超量表達(dá)載體，以對(duì)花生進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化研究。主要研究結(jié)果如下： 1.根據(jù)網(wǎng)上已發(fā)表的序列信息合成引物，分別利用PCR

3、技術(shù)從大豆總RNA中分離得到ω-3脂肪酸脫氫酶基因刷FAD3；從花生總RNA中分離得到丙酮酸羧化酶基因PEP和二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因DGAT。將PEPCase，DGAT克隆到pMD18-T中，F(xiàn)AD3構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-7s中，并進(jìn)行了測(cè)序鑒定。測(cè)定結(jié)果表明PEPCase的長(zhǎng)度為1950bp，與GenBank上引用的序列的同源性為88％；DGAT基因的長(zhǎng)度為1038bp與GenBank上引用的序列的同源性為98％；

4、FAD3的長(zhǎng)度為1173bp與GenBank上引用的序列的同源性為99％。 2.根據(jù)已克隆的PEP基因的序列設(shè)計(jì)引物，用PCR技術(shù)從載體中擴(kuò)增出三個(gè)片段，分別命名為PEP-1、PEP-2及PEP-3，然后反向與現(xiàn)有的大豆油體蛋白基因oleosin啟動(dòng)子相連，構(gòu)建到植物表達(dá)載體pCAMBIA1300 a中，得到3個(gè)反義RNA表達(dá)載體，分別命名為pCAMBIA1300 a-antiPEP-1，pCAMBIA1300 a-antiPE

5、P-2和pCAMBIA1300 a-antiPEP-3。測(cè)序表明，PEP-1、PEP-2和PEP-3已經(jīng)反向插入到植物表達(dá)載體pCAMBIA1300 a中，片段長(zhǎng)度分別為643bp、1319bp和1925bp，與已報(bào)道的相應(yīng)序列的同源性分別為90％、84％和87％；目前這3個(gè)表達(dá)載體已轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，并對(duì)花生進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化研究。 3.把已分離測(cè)序的大豆ω-3脂肪酸脫氫酶基因FAD3和花生二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因DGAT(長(zhǎng)

6、度分別為1173bp和1038bp)，分別插入本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)成的帶有大豆7s啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-7S和帶有甘藍(lán)型油菜2S啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300-2S中，獲得了兩個(gè)種子特異的超量表達(dá)載體pCAMBIA1300-FAD3和pCAMBIA1300-DGAT。 本研究共構(gòu)建了3個(gè)PEP的反義RNA植物表達(dá)載體、1個(gè)DGAT超量表達(dá)載體和1個(gè)FAD3超量表達(dá)載體。這為今后通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化，改良花生的脂肪