運(yùn)用CRISPR-Cas系統(tǒng)在大腸桿菌中異源表達(dá)希瓦氏菌脂肪酸代謝相關(guān)基因及其對脂肪酸代謝的影響.pdf

1、大腸桿菌是一個遺傳背景清楚，遺傳操作手段已經(jīng)很成熟的模式菌株，而且到目前為止工程化大腸桿菌已經(jīng)進(jìn)行了很深入的研究。而這其中工程改造脂肪酸途徑極大的吸引著研究者們的眼球，因?yàn)橹舅嶙鳛榧?xì)胞膜的組成部分，對生物體具有重要的生理意義，同時也與我們?nèi)粘Ｉ钕⑾⑾嚓P(guān)。因此在大腸桿菌體內(nèi)構(gòu)建脂肪酸生產(chǎn)的工程菌株具有重要的意義和應(yīng)用價(jià)值。
　　CRISPR/Cas是目前基因編輯的一個重要以及新興技術(shù)，利用該技術(shù)國內(nèi)外研究人員已經(jīng)開始在多個物種，

2、多種方面應(yīng)用該技術(shù)。本論文旨在以大腸桿菌作為研究對象，構(gòu)建CRISPR/Cas這個基因編輯系統(tǒng)，對大腸桿菌與脂肪酸代謝相關(guān)基因進(jìn)行改造，并引入富油脂海洋細(xì)菌(冷海希瓦氏菌)中與脂肪酸代謝相關(guān)基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，初步探索該系統(tǒng)在大腸桿菌中的應(yīng)用，通過改造脂肪酸代謝途徑來提高脂肪酸含量。據(jù)此本實(shí)驗(yàn)得出如下實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　?。?）利用http://spot.colorado.edu/~slin/cas9.html設(shè)計(jì)出了用于基因編輯

3、的spacer，然后利用重疊PCR將該序列構(gòu)建進(jìn)能在大腸桿菌中高效表達(dá)的CRISPR/Cas系統(tǒng)的載體中，獲得了在大腸桿菌中發(fā)揮作用的CRISPR/Cas系統(tǒng)載體。緊接著利用重疊PCR成功克隆出對應(yīng)的donor，最后利用電轉(zhuǎn)的方法將donor與CRISPR/Cas系統(tǒng)載體成功的導(dǎo)入宿主大腸桿菌中。
　　（2）成功構(gòu)建了ΔPEPC分，ΔPEPC，ΔPEPC分-ΔFadD，ΔPEPC-ΔFadD以及ΔFadD突變體菌株，同時也成功克隆

4、到了冷海希瓦氏菌的fadR，delta-9 desaturase和acc基因，并將這些基因分別或者串聯(lián)敲入到大腸桿菌基因組中，成功獲得了ΔPEPC::F/D，ΔPEPC::ACC以及ΔFadD::F/D和ΔFadD:ACC突變體菌株。
　?。?）針對于ΔPEPC分，ΔPEPC，ΔPEPC分-ΔFadD，ΔPEPC-ΔFadD以及ΔFadD突變體菌株，采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)對脂肪酸進(jìn)行定性及定量分析其脂肪酸含量均比野生型要

5、高，最高的增長了3.7％，但是敲出pepc基因獲得的總脂肪酸增長量并沒有預(yù)期的高，同時針對ΔDPEPC::F/D，ΔDPEPC::ACC以及ΔFadD::F/D和ΔFadD:ACC突變體菌株，與野生型相比，最高的菌株脂肪酸含量達(dá)到了13.1%，幾乎比野生型增長了5.3%。但是在脂肪酸組成山與野生型相比沒有任何變化，都含有1:0，12:0，13:0，14:0，15:0，16:0，17:1，17:0，18:0，并且16:0，17:0，18: