布魯氏菌VirB8-PCR診斷方法的建立與應(yīng)用及Ery基因的克隆與序列分析.pdf

1、根據(jù)布魯氏菌病致病力因子.四型分泌系統(tǒng)中的VirB8基因序列，設(shè)計(jì)引物，建立了檢測布魯氏菌病的PCR方法，用于布病的早期診斷和致病力因子的檢測。對布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)株、疫苗株及新疆分離株的分析檢測結(jié)果表明，VirB8-PCR檢測方法與分菌實(shí)驗(yàn)符合率為100％，特異性在90％以上，敏感性為153fgDNA(相當(dāng)于30個(gè)菌)。該方法重復(fù)性和穩(wěn)定性好，預(yù)混液-20℃保存期6個(gè)月以上。此外，本實(shí)驗(yàn)對7株布魯氏菌VirB8基因進(jìn)行了克隆測序，同源性在9

2、9.3％以上，該結(jié)果表明VirB8基因片段是一段高度保守序列，對于布魯氏菌病的檢測結(jié)果比較準(zhǔn)確、可靠。 本實(shí)驗(yàn)還采用虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)、試管凝集試驗(yàn)(SAT)、iELISA、cELISA和PCR方法對4個(gè)養(yǎng)殖場的1354只家畜(713頭牛，641只羊)進(jìn)行了布病檢測，其中牛陽性率為30.2％，羊陽性率為19.7％，檢測結(jié)果表明布病的發(fā)病率呈明顯上升趨勢。用選擇性培養(yǎng)基對采集樣品進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，同時(shí)利用VirB8-PCR

3、對布病可疑菌落(49個(gè))進(jìn)行檢測并鑒定，判定13個(gè)菌落為布魯氏菌。經(jīng)AMOS-PCR鑒別，其中12株為牛型；1株為羊型，經(jīng)生化鑒定為羊Ⅲ型。 國際標(biāo)準(zhǔn)S19株的赤蘚醇代謝基因(Erythritol catabolic gene，簡寫Ery)缺失702 bp，而我國的A19株具有完整的Ery基因。參照GenBank中布魯氏菌牛種2308的Ery基因序列，設(shè)計(jì)一對特異性引物，以國際標(biāo)準(zhǔn)參考株S19，中國天康疫苗株A19-1，中國中監(jiān)

4、所標(biāo)準(zhǔn)株A19-2的DNA為模板，擴(kuò)增不同來源的3株19號疫苗株的Ery基因，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測序分析。與2308的Ery基因比較，S19的Ery基因缺失702堿基，兩株中國來源的A19株不缺失，但該基因閱讀框的3個(gè)堿基發(fā)生了改變，即51，52位CG變?yōu)镚C，521，522，523位缺失AGG，547位T變?yōu)镃。由此而引起3個(gè)氨基酸發(fā)生了變化，即13位精氨酸(Arg)變?yōu)楸彼?Ala)，170位蘇氨酸(Thr)變?yōu)楸彼?Al