牛布魯氏菌毒力基因Virb8間接ELISA方法建立與應(yīng)用.pdf

1、布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種人獸共患性傳染病，它以流產(chǎn)和發(fā)熱為主要特征，極大阻礙了畜牧業(yè)的發(fā)展，嚴(yán)重危害了人類的健康。布魯氏菌病是世界范圍內(nèi)影響公共衛(wèi)生的一個(gè)難題，發(fā)病后如果轉(zhuǎn)入慢性就無法根治。目前，我國布魯氏菌病的流行狀況仍然令人堪憂，嚴(yán)峻的疫情形勢為該病的預(yù)防和檢測提出了更高的要求。
　　 本研究擬選取牛布魯氏菌毒力基因Virb8作為研究對象，構(gòu)建其原核表達(dá)載體，獲得高純度蛋

2、白后，利用此蛋白作為包被抗原構(gòu)建檢測奶牛布魯氏菌血清的iELISA方法，并與傳統(tǒng)的虎紅平板凝集試驗(yàn)進(jìn)行對比，探討所建立的iELISA檢測方法用于生產(chǎn)實(shí)踐的可行性。
　　 通過查閱牛布魯氏菌毒力基因Virb8序列(Gen Bank:AF226278.1)，設(shè)計(jì)一對特異性引物，在特異性引物的上游和下游分別引入BamHI酶切位點(diǎn)和HindⅢ酶切位點(diǎn)。提取布魯氏菌A19疫苗株的基因組DNA后，將其作為模板擴(kuò)增出Virb8的基因片段，片段

3、大小為720bp。將目的基因連接到pEASY-T3上，然后把產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，構(gòu)建完成重組表達(dá)質(zhì)粒pET-T3-Virb8。隨后利用限制性內(nèi)切酶BamHI和HindⅢ對pET-T3-Virb8和pET-32a(+)質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行雙酶切鑒定，證明載體已構(gòu)建成功。利用T4 DNA連接酶將試驗(yàn)所需的目的基因同表達(dá)載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化入DH5α，構(gòu)建出重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-Virb8，然后將pET-32a-Virb8轉(zhuǎn)入

4、E.coli BL21(DE3)中，用1mM/L的IPTG對其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分析和Western-blot分析鑒定后，采用Ni-NTA Spin Kit對蛋白進(jìn)行純化。將獲得的目的蛋白作為包被抗原確定iELISA方法的最佳包被濃度、最佳包被條件、最佳二抗稀釋度及陰陽性臨界值，同時(shí)進(jìn)行敏感性試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)，用所建立的iELISA方法對235個(gè)臨床奶牛血清樣本進(jìn)行檢測，并與虎紅平板凝集試驗(yàn)進(jìn)行比較。
　　 通過實(shí)