CVB3VP1阻滯Hela細胞于G1-S期的分子機制研究.pdf

1、目的：
　　研究CVB3 VP1蛋白與宿主蛋白MAT1的相互作用對細胞功能的影響，并通過檢測細胞周期素（Cyclin D1、Cyclin E1等），細胞周期素依賴性激酶（CDK4、CDK2等），細胞周期抑制基因p21以及視網(wǎng)膜母細胞瘤抑制蛋白Rb的表達水平，探討VP1將Hela細胞阻滯于G1/S期的分子機制，為研究CVB3的致病機制奠定基礎。
　　方法：
　　1.采用PCR技術擴增出VP1-D8（3044-3319bp

2、）和VP1-D4（2459-2926bp，陰性對照）基因，將其克隆至真核表達質(zhì)粒pBudCE4.1中，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒pBudCE4.1-VP1-D4和pBudCE4.1-VP1-D8，雙酶切鑒定并DNA測序驗證。
　　2.運用免疫印跡技術，檢測質(zhì)粒 pBudCE4.1-VP1、pBudCE4.1-VP1-D8、pBudCE4.1-VP1-D4以及pBudCE4.1空質(zhì)粒對Hela細胞MAT1表達量的影響。
　　3.利用流式

3、細胞儀分析以上四種質(zhì)粒對Hela細胞周期的影響。
　　4. Quantative Real-Time RT-PCR檢測以上四種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細胞24h后，細胞周期G1期檢查點基因：CDK4、CyclinD1、CDK2、Cyclin E1、CDC25A、p21的mRNA表達情況。
　　5. Quantative Real-Time RT-PCR檢測CVB3感染Hela細胞3h、6h、9h后，細胞周期G1期檢查點基因mRNA表

4、達水平。
　　6.運用免疫印跡技術，檢測以上四種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細胞24 h后，非磷酸化Rb、p-Rb Ser795、p-Rb Ser780、p-Rb Ser807/811的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1.重組質(zhì)粒雙酶切及DNA測序結(jié)果顯示 pBudCE4.1-VP1-D4和pBudCE4.1-VP1-D8構(gòu)建成功；
　　2.質(zhì)粒 pBudCE4.1-VP1、pBudCE4.1-VP1-D8、pBudCE4.1-

5、VP1-D4以及pBudCE4.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細胞24h后，Western blot檢測結(jié)果表明pBudCE4.1-VP1、pBudCE4.1-VP1-D8轉(zhuǎn)染組 MAT1表達量較pBudCE4.1-VP1-D4、pBudCE4.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義；
　　3.質(zhì)粒 pBudCE4.1-VP1、pBudCE4.1-VP1-D8、pBudCE4.1-VP1-D4以及pBudCE4.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細胞2

6、4 h后，經(jīng)流式檢測細胞周期，結(jié)果表明pBudCE4.1-VP1、pBudCE4.1-VP1-D8轉(zhuǎn)染組 G1期細胞數(shù)明顯高于pBudCE4.1-VP1-D4、pBudCE4.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學意義；
　　4.質(zhì)粒 pBudCE4.1-VP1、pBudCE4.1-VP1-D8、pBudCE4.1-VP1-D4以及pBudCE4.1轉(zhuǎn)染Hela細胞24h后，Quantative Real-Time RT-PCR結(jié)果顯示：C

7、DK4、CDK2、Cyclin D1在pBudCE4.1-VP1、pBudCE4.1-VP1-D8轉(zhuǎn)染組的表達量明顯低于pBudCE4.1-VP1-D4、pBudCE4.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，而p21呈相反的結(jié)果，差異均具有統(tǒng)計學意義；CDC25A、Cyclin E1在四個轉(zhuǎn)染組均無明顯變化；
　　5.CVB3感染Hela細胞3h、6h、9h后，Quantative Real-Time RT-PCR結(jié)果顯示：CDK4、Cyclin D1

8、、CDK2的表達量在CVB3感染Hela細胞3 h下降明顯；p21的表達量隨CVB3感染時間的延長逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義；
　　6.質(zhì)粒 pBudCE4.1-VP1、pBudCE4.1-VP1-D8、pBudCE4.1-VP1-D4以及pBudCE4.1轉(zhuǎn)染Hela細胞24h后，Western blot檢測結(jié)果表明：p-Rb Ser780、p-Rb Ser807/811在pBudCE4.1-VP1、pBudCE4.1-VP1-

9、D8轉(zhuǎn)染組的表達量明顯低于pBudCE4.1-VP1-D4、pBudCE4.1空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，而非磷酸化Rb呈相反的結(jié)果，差異均有統(tǒng)計學意義；p-Rb Ser-795位點的磷酸化水平在四個轉(zhuǎn)染組均無明顯變化。
　　結(jié)論：
　　本論文提示：
　　1. CVB3感染細胞后，通過VP1-D8與MAT1蛋白相互作用引起MAT1表達下調(diào)，導致CAK活性降低，而活性減弱的CAK使得CDK4、Cyclin D1、CDK2等基因表達下調(diào)