RNAi聯(lián)合沉默uPAR和CathepsinB基因誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞遷移能力抑制和G0-G1期阻滯的作用機(jī)制.pdf

1、目的：通過(guò)RNA干擾單獨(dú)和聯(lián)合沉默肝癌SMMC-7721細(xì)胞的uPAR(纖溶酶原激活物受體)和Cathepsin B(組織蛋白酶B),研究其對(duì)肝癌細(xì)胞遷移、細(xì)胞周期阻滯以及Integrinα6(整合素α6)、MMP-9(基質(zhì)金屬蛋白酶-9)、ERK(細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶)、PI3K(磷脂酰肌醇-3-羥激酶)通路的信號(hào)影響,進(jìn)一步探討肝癌的靶向治療,為肝癌治療的新策略提供理論依據(jù)。
　　方法：培養(yǎng)肝癌SMMC-7721細(xì)胞、用熒光標(biāo)記

2、的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后觀察轉(zhuǎn)染效率。用uPAR,Cathepsin B靶向siRNA沉默SMMC-7721細(xì)胞。將肝癌細(xì)胞分成5組:空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、uPAR-siRNA轉(zhuǎn)染組、
　　Cathepsin B-siRNA轉(zhuǎn)染組、uPAR-siRNA/Cathepsin B-siRNA聯(lián)合轉(zhuǎn)染組;用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期;用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)癌細(xì)胞遷移能力;用RT-qPCR法檢測(cè)肝癌細(xì)胞mmp-9(基質(zhì)金屬蛋白酶)、integri

3、nα6(整合素α6)基因表達(dá);用Western blot法檢測(cè)肝癌細(xì)胞t-ERK,p-ERK,t-PI3K,p-PI3K,integrinα6蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.用低濃度熒光標(biāo)記的uPAR,Cathepsin B靶向siRNA轉(zhuǎn)染7721細(xì)胞。24小時(shí)后在倒置熒光顯微鏡下觀察,細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率在85％以上,細(xì)胞狀態(tài)良好。
　　2.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。用uPAR,Cathepsin B靶向siRNA沉默

4、7721細(xì)胞,在0、12、24、36、48小時(shí)分5個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察記錄。與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組肝癌細(xì)胞遷移能力明顯下降,其中聯(lián)合沉默組下降效果最為明顯。
　　3.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組肝癌細(xì)胞G0/G1期(合成前期)細(xì)胞數(shù)明顯增加,其中聯(lián)合沉默組增加最為明顯。
　　4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)integrinα6及MMP-9 mRNA表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組integri

5、nα6及MMP-9 mRNA表達(dá)水平均明顯下降,其中聯(lián)合沉默組下降最為明顯。
　　5. WB實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)各組integrinα6、PI3K、ERK蛋白表達(dá)量。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組integrinα6、p-PI3K、p-ERK明顯下降,其中聯(lián)合沉默組增加最為明顯。
　　結(jié)論: RNAi聯(lián)合沉默uPAR和Cathepsin B基因可以降低肝癌細(xì)胞的遷移能力,誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1期阻滯,主要機(jī)制可能為通過(guò)抑制Inte