Elongator對肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　通過研究Elp3過表達(dá)和Elp3干擾表達(dá)的HepG2細(xì)胞株以及Elp4過表達(dá)和Elp4干擾表達(dá)的HepG2細(xì)胞株的遷移侵襲能力的改變，探討Elp3和Elp4對肝癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響及其分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.鑒定Elp3干擾質(zhì)粒GV248-Elp3i和Elp4干擾質(zhì)粒GV248-Elp4i，以及Elp3過表達(dá)質(zhì)粒pFLAG-CMV4-Elp3o和Elp4過表達(dá)質(zhì)粒pFLAG-CMV4-Elp4

2、o。
　　2.確定肝癌細(xì)胞HepG2的Puror和G418藥物篩選濃度。
　　3.轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒后的HepG2細(xì)胞經(jīng) Puror篩選得到Elp3穩(wěn)定干擾細(xì)胞株和Elp4穩(wěn)定干擾細(xì)胞株；轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒后的HepG2細(xì)胞經(jīng) G418篩選得到 Elp3過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株和Elp4過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株。
　　4.通過RT-PCR、Real-time PCR和Western blot鑒定各組細(xì)胞株中外源質(zhì)粒的整合，檢測Elp3和Elp4

3、的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　5.劃痕實(shí)驗(yàn)，Transwell侵襲遷移實(shí)驗(yàn)檢測各細(xì)胞株遷移和侵襲能力的改變。
　　6. Real-time PCR檢測各細(xì)胞株中MMP-2、MMP-9和Paxillin的mRNA表達(dá)水平。
　　7. Western blot檢測各細(xì)胞株中 PI3K、AKT、p-AKT、MMP-2、MMP-9和Paxillin的蛋白表達(dá)水平。
　　8. Western blot檢測瞬時轉(zhuǎn)染不同劑量

4、Elp3過表達(dá)質(zhì)粒pFLAG-CMV4-Elp3o、Elp4過表達(dá)質(zhì)粒pFLAG-CMV4-Elp4o、Elp3干擾質(zhì)粒GV248-Elp3i和Elp4干擾質(zhì)粒GV248-Elp4i的細(xì)胞株中PI3K、AKT和p-AKT的蛋白表達(dá)水平。
　　9.通過Western blot檢測PI3K、AKT和p-AKT的蛋白表達(dá)水平確定肝癌細(xì)胞HepG2的PI3K/AKT途徑抑制劑LY294002的濃度。
　　10.劃痕實(shí)驗(yàn)，Transw

5、ell侵襲遷移實(shí)驗(yàn)檢測抑制劑 LY294002處理后的各細(xì)胞株遷移和侵襲能力的改變。
　　11. Real-time PCR檢測抑制劑 LY294002處理后的各細(xì)胞株中 MMP-2和MMP-9的mRNA表達(dá)水平。
　　12. Western blot檢測抑制劑 LY294002處理后的各細(xì)胞株中 PI3K、AKT、p-AKT、MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定，成功檢測

6、到 Elp3過表達(dá)質(zhì)粒：pFLAG-CMV4-Elp3o中1601bp的重組Elp3條帶；Elp4過表達(dá)質(zhì)粒：pFLAG-CMV4-Elp4o中1613bp的重組Elp4條帶；Elp3干擾質(zhì)粒：GV248-Elp3i中44bp的shRNA條帶；Elp4干擾質(zhì)粒：GV248-Elp4i中44bp的shRNA條帶。
　　2. HepG2細(xì)胞于含不同濃度 G418或 Puror的培養(yǎng)基中培養(yǎng)14天后，得出50ng/μl為Puror藥物篩

7、選濃度，600ng/μl為G418藥物篩選濃度。
　　3. HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染各組質(zhì)粒24h后，加入G418或Puror篩選14天，經(jīng)單克隆挑取和單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)及鑒定，得到目標(biāo)細(xì)胞株。
　　4.劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)證明了Elp3和Elp4過表達(dá)能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移能力和侵襲能力，干擾Elp3和Elp4則抑制肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　5. Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)Elp3和Elp4過表達(dá)能增加

8、肝癌細(xì)胞中的MMP-2、MMP-9和Paxillin的mRNA表達(dá)水平，干擾 Elp3和 Elp4則抑制肝癌細(xì)胞中的MMP-2、MMP-9和Paxillin的mRNA表達(dá)水平
　　6. Western blot檢測各細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)Elp3和 Elp4過表達(dá)能增加肝癌細(xì)胞中p-AKT、MMP-2、MMP-9和Paxillin的蛋白表達(dá)水平，干擾Elp3和Elp4則抑制肝癌細(xì)胞中的p-AKT、MMP-2、MMP-9和Paxillin的蛋

9、白表達(dá)水平。
　　7. Western blot檢測瞬時轉(zhuǎn)染不同劑量Elp3過表達(dá)質(zhì)粒pFLAG-CMV4-Elp3o、Elp4過表達(dá)質(zhì)粒pFLAG-CMV4-Elp4o、Elp3干擾質(zhì)粒GV248-Elp3i和Elp4干擾質(zhì)粒GV248-Elp4i的細(xì)胞株中PI3K、AKT和p-AKT的蛋白表達(dá)水平，得出Elp3和Elp4的表達(dá)量與AKT磷酸化水平兩者間存在劑量效應(yīng)。
　　8.劃痕實(shí)驗(yàn)，Transwell侵襲遷移實(shí)驗(yàn)檢測，

10、加入抑制劑 LY294002處理后，能抑制各細(xì)胞株遷移和侵襲能力。
　　9. Real-time PCR檢測抑制劑LY294002處理后，HepG2細(xì)胞株、Elp3過表達(dá)細(xì)胞株和Elp4過表達(dá)細(xì)胞株中MMP-2和MMP-9的mRNA表達(dá)水平降低，Elp3干擾細(xì)胞株和Elp4干擾細(xì)胞株中MMP-2和MMP-9的mRNA表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。
　　10. Western blot檢測抑制劑LY294002處理后的各細(xì)胞株中p-A