構(gòu)建細胞周期G1期和S期特異性光學分子報告基因以及監(jiān)測抗腫瘤藥物阻滯細胞周期的應用.pdf

1、背景與目的：細胞周期是指以有絲分裂方式進行增殖的細胞從一次分裂完成時開始到下一次分裂完成時為止所經(jīng)歷的全過程。通常由G1期、S期、G2期和M期組成。細胞在G1期完成必要的生長和物質(zhì)準備，在S期完成染色體DNA的復制。當前研究表明，細胞周期紊亂是人類惡性腫瘤的共同特征，而臨床上使用的許多抗腫瘤藥物，其作用靶點也是針對控制細胞周期的關(guān)鍵蛋白。cyclin E在 G1期表達，S期降解，通過激活 CDK2促進細胞周期進入 S期，Skp2的表達水

2、平在G0/G1期非常低,而在S期表達增加。光學分子影像技術(shù)是應用光學成像在分子或細胞水平上研究活體狀態(tài)下的生理，光學成像的報告基因分子如螢火蟲（Firefly）熒光素酶，已經(jīng)成為一個受歡迎的跟蹤和可視化活體動物的方法,本研究的目的在于構(gòu)建細胞周期G1期和S期特異性光學分子報告基因，通過分子影像學及生物發(fā)光成像技術(shù)，監(jiān)測抗腫瘤藥物對細胞周期的阻滯，為在體、實時、無創(chuàng)的檢測細胞周期的改變提供較好的模型。
　　材料與方法：cyclin

3、E蛋白和Skp2蛋白的表達具有依賴細胞周期變化而波動的特性，我們利用熒光素酶基因可以應用于活體進行成像的特點，應用融合蛋白構(gòu)建技術(shù)構(gòu)建cyclin E-luc2和Skp2-luc2基因真核表達載體，通過篩選建立穩(wěn)定表達兩個融合蛋白的Hela腫瘤細胞株，并挑取熒光素酶活性較高的單克隆。使用動物活體成像的技術(shù)檢測cyclin E-luc2和 Skp2-luc2是否可以在體監(jiān)測細胞周期的變化；采用流式細胞術(shù)的方法檢測藥物刺激2株單克隆細胞株后

4、，細胞周期的變化與成像系統(tǒng)所監(jiān)測到的熒光素酶活性的變化是否一致。
　　結(jié)果：cyclin E-luc2和Skp2-luc2的表達水平均隨細胞周期變化而變化，分別在 G1期和S期達到最高點。流式細胞檢測兩穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株在PD0332991抗腫瘤藥處理后結(jié)果顯示G1期細胞阻滯增多。此時，cyclin E-luc2單克隆細胞株熒光素酶活性于24h時明顯上升約4倍。Skp2-luc2單克隆細胞株熒光素酶活性上升約4倍。
　　結(jié)論：成功構(gòu)