RNAi特異性抑制ORC1基因?qū)Υ笫笃交〖?xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響.pdf

1、研究背景和目的：血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmoothmusclecell，VSMC)是血管壁的主要組成部分。VSMC的異常增殖是動(dòng)脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄等的主要病理基礎(chǔ)。RNA干擾(RNAinterfering，RNAi)作為一種新型的研究基因功能、進(jìn)行基因治療的工具，它具有高效、高特異性的特點(diǎn)。起始識(shí)別復(fù)始物(originrecognitioncomplex，ORC)是細(xì)胞DNA復(fù)制中識(shí)別復(fù)制起始位點(diǎn)的蛋白質(zhì)，它由6個(gè)

2、亞基組成。ORC最早在酵母菌中發(fā)現(xiàn)，之后在多種原核生物、真核生物及人的多種組織、細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)有ORC的存在，是各種細(xì)胞進(jìn)行DNA復(fù)制所必須的。當(dāng)ORC與DNA的復(fù)制起始位點(diǎn)特異結(jié)合后，形成一個(gè)平臺(tái)，之后cdc6、Cdt1及MCM2-7相繼結(jié)合到ORC上，形成復(fù)制前復(fù)合物。復(fù)制前復(fù)合物在多種蛋白和激酶的作用下活化，促進(jìn)細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，逐步完成DNA的復(fù)制。細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)ORC的活性來(lái)調(diào)控細(xì)胞DNA復(fù)制。在芽殖酵母，ORC在整個(gè)細(xì)胞周期

3、中始終結(jié)合在起始點(diǎn)上；在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，ORC2-6在細(xì)胞周期各階段均與染色體結(jié)合，而ORC1在S期卻從核酸上解離下來(lái)，直到下一個(gè)細(xì)胞周期的G1期才重新結(jié)合到染色體上。在真核細(xì)胞中ORC1亞基的量在細(xì)胞周期中呈現(xiàn)周期性波動(dòng)(G1中期開(kāi)始積累，S期開(kāi)始減少)，而ORC2-6在整個(gè)細(xì)胞周期保持穩(wěn)定，這種ORC1的周期性波動(dòng)被稱(chēng)為“ORC1周期”。ORC1是調(diào)節(jié)ORC活性的關(guān)鍵因素。以前，抑制VSMC生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)研究多是從各種信號(hào)分子或信號(hào)傳導(dǎo)通

4、路的角度來(lái)進(jìn)行探討，以阻斷DNA復(fù)制的起始來(lái)抑制VSMC增殖的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因細(xì)胞增殖必須通過(guò)DNA復(fù)制把遺傳信息傳遞給子代，細(xì)胞DNA的復(fù)制是通過(guò)ORC特異地結(jié)DNA復(fù)制起始位點(diǎn)來(lái)起動(dòng)，并通過(guò)調(diào)節(jié)ORC的活性來(lái)調(diào)控的，而ORC1是調(diào)節(jié)ORC活性的關(guān)鍵因素。基于這一認(rèn)識(shí)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)脂質(zhì)介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染大鼠VSMC，對(duì)大鼠ORC1基因表達(dá)進(jìn)行RNAi，觀察其對(duì)大鼠VSMC細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響，為動(dòng)脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄提供

5、新的思路和方法。 研究方法： 1.用組織塊貼壁法培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈VSMC用作體外對(duì)ORC1進(jìn)RNAi、觀察其在細(xì)胞增增殖、細(xì)胞周期上變化的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。用免疫組化檢測(cè)α-SM-actin以鑒定VSMC。 2.使用專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)用于轉(zhuǎn)染RNA的脂質(zhì)體試劑合對(duì)VSMC進(jìn)siRNA轉(zhuǎn)染。通過(guò)RT-PCR、Westernblot技術(shù)觀察RNAi對(duì)ORC1的抑制效果。 3.特異性抑制ORC1對(duì)大鼠VSMC增殖能力影響的檢測(cè)分別

6、用MTT試驗(yàn)、3H-TdR摻入試驗(yàn)及免疫組化測(cè)定增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的量來(lái)檢測(cè)。 4.特異性抑制ORC1對(duì)大鼠VSMC細(xì)胞周期影響的檢測(cè)用流式細(xì)胞儀測(cè)定RNAi后不同時(shí)相點(diǎn)各細(xì)胞周期所占比率來(lái)觀察。 研究結(jié)果： 1.本實(shí)驗(yàn)用組織塊貼壁法成功地在體外培養(yǎng)了大鼠VSMC，并經(jīng)免疫化學(xué)證實(shí)，為下一步實(shí)驗(yàn)建立了平臺(tái)； 2.以3對(duì)siRNA轉(zhuǎn)染VSMC，抑制ORC1的mRNA及蛋白質(zhì)效果的檢測(cè)選擇了的下一步用

7、于干預(yù)實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性siRNA。 3.對(duì)ORC1進(jìn)行RNAi后，VSMC增殖能力顯著下降：與未轉(zhuǎn)染組相比，MTT吸光度值由0.3693±0.0264下降至O.1807±0.0398(p＜0.05)，3H-TdR檢測(cè)值由12614.20±2375.26下降至2443.20±934.99(p＜0.05)，PCNA陽(yáng)性細(xì)胞率分別由73.74±7.64％下降至28.89±7.34％(p＜0.05)。 4.對(duì)ORC1進(jìn)行RNAi，血清