CVB3對Hela細(xì)胞高爾基體及其細(xì)胞周期的影響.pdf

1、目的： 探討CVB3（Coxsackievirus B3）對Hela （Henrietta Lacks strain of cancer cells）細(xì)胞高爾基體及其細(xì)胞周期的影響，為研究CVB3的致病機制奠定基礎(chǔ)。 方法： 將Hela細(xì)胞株作為敏感宿主細(xì)胞進行以下實驗，用MOI（multiplicity of infection）為5的CVB3感染細(xì)胞： 1、免疫熒光雙標(biāo)檢測病毒感染后0h、1.5 h、

2、3h、4.5 h和6h等時間點VP1、GM130（Golgi matrix protein 130）和GRASP65（Golgi reassembly stacking protein 65）在細(xì)胞中的定位； 2、選擇CVB3感染0h、1.5 h、3h、4.5 h、6h、7.5 h、9h、10.5 h、12 h、13.5 h、15 h、16.5 h、18 h、21h和24 h等時間點收集細(xì)胞，進行總蛋白定量后，Western B

3、lot檢測VP1、GM130和GRASP65蛋白的表達變化； 3、分別選擇G1/S期或G2/M期同步化細(xì)胞釋放0h、3h、6h和9h等時間點，流式細(xì)胞儀檢測CVB3病毒感染組與正常細(xì)胞組之間的細(xì)胞周期差異。 結(jié)果： 1、免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示： （1）GM130和GRASP65的免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示：GM130與GRASP65之間存在明顯共定位，正常Hela細(xì)胞高爾基體位于近核區(qū)，高爾基帶連續(xù)。 （

4、2）GM130和VP1的免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示：正常細(xì)胞GM130免疫熒光呈帶狀分布，位于近核區(qū)；而自病毒感染3h后，GM130的熒光在病毒感染細(xì)胞中出現(xiàn)散點狀分布。 （3）GRASP65和VP1的免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示：正常細(xì)胞GRASP65免疫熒光呈帶狀分布，位于近核區(qū)；而自病毒感染3h后，GRASP65的熒光開始出現(xiàn)較明顯的彌散分布。 2、Western blot結(jié)果顯示：GM130的表達量自病毒感染后逐漸下降，至病毒

5、感染18h后未檢測出GM130的表達；GRASP65的表達量變化趨勢與GM130基本一致，但病毒感染12h后即未檢測出其表達；VP1的蛋白表達量自病毒感染開始即持續(xù)上升，6h后一直維持在較高水平。 3、流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示： （1）對胸苷雙阻斷法同步在G1/S期的細(xì)胞，釋放0h、3h、6h和9h后，正常細(xì)胞組G1期的細(xì)胞比例分別是：89.14％、65.77％、14.14％和13.11％；而病毒感染細(xì)胞組G1期細(xì)胞比例分

6、別是：91.08％、84.41％、81.81％和81.74％。 （2）經(jīng)諾考達唑（Nocodazole）作用后，G2期的細(xì)胞比例由非同步化狀態(tài)時的4.62％上升到40％以上，表明諾考達唑已將部分細(xì)胞同步化G2/M期；同步化釋放0h、3h、6h和9h后，正常細(xì)胞組G2期細(xì)胞比例分別是：42.99％、51.93％、37.97％和21.35％；而病毒感染細(xì)胞組G2期細(xì)胞比例分別是：61.25％、43.34％、29.37％和27.62％

7、，與此同時G1期細(xì)胞比例分別是：8.48％、28.01％、28.10％和33.46％0 結(jié)論： 1、CVB3感染引起Hela細(xì)胞高爾基帶斷裂，高爾基體結(jié)構(gòu)受到影響。這可能是CVB3感染導(dǎo)致宿主細(xì)胞病變效應(yīng)的機制之一。 2、CVB3感染下調(diào)了GM130和GRASP65的表達。GM130和GRASP65的蛋白表達下降可能是高爾基體結(jié)構(gòu)破壞的機制之一。 3、CVB3感染G1/S期細(xì)胞后，細(xì)胞周期主要停滯在G1期