siRNA干擾CDKs對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：CDK1siRNA干擾對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響
　　 目的：研究CDK1 siRNA干擾抑制CDK1的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響。
　　 材料和方法：以人宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞和人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480細(xì)胞為研究對(duì)象，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CDK1 siRNA，分別用realtime-PCR、westernblot檢測(cè)CDK1基因和蛋白的表達(dá)，AnnexinV/PI法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡

2、，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布，細(xì)胞進(jìn)行瑞氏-姬姆薩染色后鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化。
　　 結(jié)果：轉(zhuǎn)染CDK1 siRNA后CDK1基因和蛋白的表達(dá)都下降。轉(zhuǎn)染后24 小時(shí)，CDK1 蛋白表達(dá)已經(jīng)下降，到轉(zhuǎn)染后48小時(shí)、60 小時(shí)，CDK1基因與蛋白都明顯降低。轉(zhuǎn)染CDK1 siRNA 48和60 小時(shí)后的細(xì)胞周期G2/M 期比例明顯增加，而細(xì)胞凋亡率與對(duì)照相比沒(méi)有明顯升高。轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)瑞氏-姬姆薩染色后，顯微鏡下看到雙核細(xì)胞增多。

3、r>　　 結(jié)論：CDK1 siRNA干擾導(dǎo)致的CDK1表達(dá)降低只引起細(xì)胞周期G2/M 期阻滯，細(xì)胞增殖減慢，沒(méi)有導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　 第二部分：CDK1siRNA干擾在Taxol誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用
　　 目的：研究轉(zhuǎn)染CDK1 siRNA 在Taxol誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中的對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響，探討CDK1 在細(xì)胞凋亡中的確切作用。
　　 方法：以人宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞和人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480細(xì)胞為研究

4、對(duì)象，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CDK1 siRNA，轉(zhuǎn)染后48 小時(shí)加Taxol(20g/ml)刺激，實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照（未處理）、陰性對(duì)照（轉(zhuǎn)染陰性 siRNA）、空白對(duì)照加Taxol、陰性對(duì)照加Taxol、轉(zhuǎn)染CDK1 siRNA、轉(zhuǎn)染CDK1 siRNA 加Taxol 實(shí)驗(yàn)組。加藥12 小時(shí)后收集細(xì)胞，用AnnexinV/PI方法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞DNA含量，分析細(xì)胞周期的變化；westernblot檢測(cè)CDK1、BCL2 蛋白的表

5、達(dá)。
　　 結(jié)果：CDK1 蛋白表達(dá)水平在轉(zhuǎn)染siRNA組都有明顯降低。Taxol(20ug/ml)刺激12 小時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)明顯G2/M 期和S 期阻滯以及細(xì)胞凋亡。細(xì)胞轉(zhuǎn)染CDK1 siRNA后再用Taxol刺激，G2/M、S 期阻滯效應(yīng)和細(xì)胞的凋亡反應(yīng)都沒(méi)有明顯改變。抗凋亡蛋白BCL2 也只在加Taxol 刺激組表達(dá)下降。
　　 結(jié)論：siRNA干擾導(dǎo)致的CDK1表達(dá)降低對(duì)紫杉醇Taxol所誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡

6、作用沒(méi)有影響。
　　 第三部分：共轉(zhuǎn)染CDK1、CDK2siRNA對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響
　　 目的：研究共轉(zhuǎn)染CDK1、CDK2 siRNA 同時(shí)抑制CDK1、CDK2 蛋白表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響，探討細(xì)胞周期主要調(diào)控分子在細(xì)胞凋亡中的確切作用。
　　 方法：以人宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞和人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480細(xì)胞為研究對(duì)象，用脂質(zhì)體lipofactamine2000 同時(shí)轉(zhuǎn)染CDK1和CDK2 si

7、RNA。在轉(zhuǎn)染后48、60 小時(shí)收集細(xì)胞，用westernblot檢測(cè)CDK1、CDK2 蛋白的表達(dá)和抗凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)，AnnexinV/PI檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡，流式細(xì)胞術(shù)DNA含量檢測(cè)分析細(xì)胞周期阻滯。AnnexinV/PI標(biāo)記的細(xì)胞同時(shí)在激光共聚焦顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)；另外轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行瑞氏-姬姆薩染色后在普通光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)變化。
　　 結(jié)果：共轉(zhuǎn)染CDK1、CDK2siRNA后48 小時(shí)和60 小時(shí)，W

8、esternBlot結(jié)果顯示CDK1和CDK2 蛋白的表達(dá)都同時(shí)降低。共轉(zhuǎn)染CDK1、CDK2 siRNA后，細(xì)胞周期在S 期和G2/M 期都出現(xiàn)阻滯，轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)瑞氏-姬姆薩染色后在顯微鏡下可見(jiàn)雙核或多核細(xì)胞增多；AnnexinV結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)染CDK1、CDK2 siRNA的細(xì)胞在48 小時(shí)和60 小時(shí)都發(fā)生了明顯的凋亡，激光共聚焦顯微鏡下的形態(tài)學(xué)觀察也可見(jiàn)到早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞，但westernblot結(jié)果顯示凋亡蛋白Bcl2的含