2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、流式細(xì)胞術(shù) Flow Cytometry,(FCM),什么是流式細(xì)胞儀,,●流式細(xì)胞儀實物,BD FACSVantage,BD-Calibur,1. 發(fā)展歷史1934 Moldavan 1973 Steinkamp,一、  概述,2. 定義:對在高速流動的鞘液包括下對特異熒光標(biāo)記的細(xì)胞、粒子進行分析和分選的技術(shù).3. 特點測量速度快,每秒鐘能測數(shù)千個乃至上萬個細(xì)胞可

2、進行多參數(shù)測量在分析的同時可把具有指定特征的細(xì)胞分離出來,即分選技術(shù)。,凡是能被熒光素標(biāo)記的細(xì)胞或顆粒都可用流式細(xì)胞儀檢測。前提這種熒光素能被流式細(xì)胞儀所配置的激光光源激發(fā)在生物檢測技術(shù)中流式細(xì)胞儀是不可多得的一機多用的儀器。,4. 應(yīng)用范圍,二、流式細(xì)胞儀的工作原理和基本結(jié)構(gòu),待測細(xì)胞以單個細(xì)胞的懸液,經(jīng)特異性熒光染料染色,放入樣品管,吸入流動室。流動室充滿鞘液,作用:約束樣品在噴嘴中心,防止樣品靠近噴孔壁堵塞噴孔。細(xì)胞排成

3、單列由噴嘴中心噴出,形成細(xì)胞液柱。,液柱與激光束相交,細(xì)胞上的熒光染料被激發(fā)產(chǎn)生熒光。熒光信號變成電信號輸出到計算機,軟件分析。,,基本結(jié)構(gòu),流動室和液流系統(tǒng);激光源和光學(xué)系統(tǒng);光電管和檢測系統(tǒng);計算機和分析系統(tǒng)。,三、 流式細(xì)胞儀可檢測到的細(xì)胞參數(shù),非熒光信號,顆粒度,,,細(xì)胞大小,前向角散射光(FSC)細(xì)胞相對大小及其表面積 側(cè)向角散射光(SSC)細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的相對復(fù)雜性,血液涂片,外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點圖

4、,,,,熒光信號,熒光強度(FL):細(xì)胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光,不同的熒光染料其發(fā)射波長不同。有熒光標(biāo)記的細(xì)胞與無熒光標(biāo)記的區(qū)分開來(陰陽)高FL細(xì)胞與低FL細(xì)胞區(qū)分開來(強弱)一般的流式細(xì)胞儀只裝有一個激光光源(488nm),可測出三個FL,即FL1、FL2、FL3,大型的流式細(xì)胞儀裝有兩個或三個激光光源(488nm、633nm和325nm),可測出6個FL。,熒光信號與細(xì)胞特性,熒光染料被激發(fā)而發(fā)射的光信號。

5、 定量染色 熒光信號大小 被標(biāo)記組分含量的定量 多熒光標(biāo)記胞內(nèi)多種組分,實現(xiàn)多參數(shù)測量,,,,光信號分離,導(dǎo)向各探測通道接收并轉(zhuǎn)化為電信號。,光信號收集,三 數(shù)據(jù)處理及流式報告,,,,,,FSC SSC FL1 FL2 FL3,,,,,,對數(shù) 線性 線性 線

6、性 對數(shù),脈沖處理,模數(shù)轉(zhuǎn)換,光信號,電信號,,,記錄數(shù)據(jù),顯示結(jié)果,(面積,峰高,寬度),流式報告的圖一般分為四種,即散點圖、直方圖、密度圖和二維等高圖等。最常用的為散點圖和直方圖。幾個概念:%Gated:陽性細(xì)胞百分比。反映細(xì)胞群體中陽性細(xì)胞的數(shù)量。Mean:平均熒光強度,與被檢測物質(zhì)的表達(dá)量有關(guān),在正態(tài)分布時一般用該值。Geo Mean:幾何平均熒光強度,在陽性細(xì)胞為偏態(tài)分布時一般用該值。,散點圖,密度圖,二維等高

7、圖,直方圖,圖 報告中常見的幾種流式細(xì)胞圖,圖 Annexin V/PI雙標(biāo)記分析細(xì)胞凋亡和壞死,流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析,點圖分析,流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析,直方圖分析,圖中100~101(M1)為陰性細(xì)胞,101以上的(M2)為陽性細(xì)胞,五、 流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用,細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞顆粒度細(xì)胞表面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量……,細(xì)胞功能細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原細(xì)胞活性細(xì)胞內(nèi)/外的細(xì)胞因子激

8、素結(jié)合位點、細(xì)胞受體蛋白磷酸化pH值鈣離子濃度細(xì)胞膜電位、線粒體膜電位 ……,一) 細(xì)胞DNA含量檢測,細(xì)胞固定后用PI (Propidium iodide碘化丙啶),染色,因為PI特異性結(jié)合于細(xì)胞DNA,熒光強度與PI的結(jié)合量呈良好的線性關(guān)系,根據(jù)這個原理,可測出細(xì)胞的DNA含量。用于細(xì)胞周期、細(xì)胞倍體以及凋亡的檢測。,,單參數(shù)直方圖,圖中2N代表G0/G1期細(xì)胞,4N代表G2/M期細(xì)胞,兩者中間代表S期細(xì)胞。這是以2倍體

9、和4倍體細(xì)胞為主的流式DNA圖,DNA細(xì)胞周期分析,細(xì)胞周期,,,,,,,,,,,G2,M,G0,G1,s,200,400,600,800,1000,,,,,,s,DNA分析,DNA含量,細(xì)胞數(shù)量,,2倍體,異倍體,4倍體,腫瘤組織中的各種DNA倍體,含量與凋亡關(guān)系,DNA亞G1峰的檢測:利用PI染色,檢測具有亞G1期DNA含量的細(xì)胞比例,代表凋亡細(xì)胞數(shù)。凋亡過程中,細(xì)胞內(nèi)核酸酶的釋放,將DNA降解,分解成小的片段,在標(biāo)本制備中的固定

10、處理時,細(xì)胞膜的完整性被破壞,使細(xì)胞內(nèi)降解的DNA片段從細(xì)胞內(nèi)流出,造成總體DNA含量減少,成為亞2倍體。,二)腫瘤診斷與抗腫瘤藥物研究,1. 腫瘤診斷,DNA異倍體的出現(xiàn)是癌變的一個重要標(biāo)志細(xì)胞的增殖能力的大小也可反映腫瘤的生物學(xué)特征利用流式細(xì)胞儀進行細(xì)胞周期分析和DNA倍性分析,輔助腫瘤診斷,包括監(jiān)測癌前病變、腫瘤的早期診斷和腫瘤細(xì)胞學(xué)診斷。,2倍體,異倍體,4倍體,腫瘤組織中的各種DNA倍體,2. 凋亡研究,在G0/G1峰前出

11、現(xiàn)一個亞二倍體峰,即凋亡峰。檢測調(diào)亡,可進行抗腫瘤藥物研究和某些因素對細(xì)胞的損傷機理的研究。,Annexin V Assay,,,,圖 Annexin V/PI雙標(biāo)記分析細(xì)胞凋亡和壞死,Date acquired: 14-Jan-03File: 7Gy 4hr.001Source: dongboDIPLOID: 100.00 % Dip G0-G1: 73.12 % at 48.16 Dip G2-M: 9.59 %

12、at 96.33 Dip S: 17.29 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 6.04Apoptosis: 13.66 % Mean: 27.48,圖 FCM測試細(xì)胞周 期分布和凋亡,根據(jù)凋亡細(xì)胞的特點來檢測,在形態(tài)上,早期細(xì)胞核固縮,染色體邊集在核膜內(nèi)側(cè)顯新月體形、核碎裂;細(xì)胞漿和細(xì)胞器密度增高、細(xì)胞體積變??;細(xì)胞膜皺折卷曲,但早期細(xì)胞膜的完整性未受到破壞凋亡細(xì)胞的FSC ?SSC

13、 ?細(xì)胞壞死時,細(xì)胞腫脹,F(xiàn)SC ?,SSC ?,CD3(T細(xì)胞,CD4、CD8))、CD19(B細(xì)胞)、CD16、CD56(NK細(xì)胞),原發(fā)性或繼發(fā)性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴細(xì)胞增殖病、腫瘤療效觀察與預(yù)后判斷、移植免疫檢測等。,三)淋巴細(xì)胞分類,,,,,,,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表型,流式細(xì)胞術(shù)白血病免疫分型是利用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體作分子探針,多參數(shù)分析白血病細(xì)胞的免疫表型,了解被測白血病細(xì)胞所屬細(xì)胞系列及其分化程度。

14、FCM分析白血病免疫表型, 快速、特異、準(zhǔn)確,重復(fù)性好,能區(qū)分細(xì)胞起源、劃分其分化發(fā)育階段等,對白血病的診斷與分型、治療方案選擇與預(yù)后判斷、發(fā)病機理研究等有重要價值。,四)白血病的免疫分型,五) 細(xì)胞內(nèi)蛋白的分析:,細(xì)胞破膜后將細(xì)胞內(nèi)某一蛋白成分進行熒光標(biāo)記,用流式細(xì)胞儀進行測量分析,同表型分析一樣,可以測量出這種陽性細(xì)胞的數(shù)量和這種蛋白的相對含量。熒光探針多為FITC。,熒光信號,使用不同熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色,做多色分析熒光信

15、號的強弱,反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量,熒光樣本制備,雙色直接染色,端粒(熒光蛋白),六)細(xì)胞內(nèi)鈣離子測定1×106/ml的細(xì)胞懸液,加入終濃度為1-5μmol/ml Fluo-3/AM,充分混勻,室溫避光作用60分鐘。以HEPES緩沖的Hank’s平衡鹽溶液洗三次,重懸于0.5ml同樣的溶液,上流式細(xì)胞儀檢測。根據(jù)報告中給出的樣品熒光強度計算細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度。,,,FCM檢測胞內(nèi)鈣離子、膜電位和線粒體功能,M1陰性界

16、限劃分完全是根據(jù)陰性對照!如下圖:紅色部分代表陰性對照,即:所檢測的物質(zhì)在陰性組中的基礎(chǔ)表達(dá)量,可以理解為背景、靜息狀態(tài)下、基礎(chǔ)水平、未受刺激時等。藍(lán)色部分即陽性組,也就是接受刺激后,功能狀態(tài)下、藥物作用后等。,六. 分選:,用熒光探針標(biāo)記的細(xì)胞,可被有效地分離出來,用于分選的效率較高的儀器國內(nèi)較少,臺式機一般分選速度為每秒鐘300個細(xì)胞,大型機分選速度可達(dá)到每秒上萬個細(xì)胞,,,,,,488 nm laser,,-,,,,,,,,,

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