流式細(xì)胞儀的應(yīng)用

1、流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用,流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）是一種近年發(fā)展起來的比較先進(jìn)的技術(shù)，它利用流式細(xì)胞儀對特定細(xì)胞群體進(jìn)行分選或?qū)ι镂⒘＿M(jìn)行多參數(shù)快速定量分析［1］ 。FCM集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、電子計算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。FACSCalibur性能卓越，不僅通過其用戶友好的整體設(shè)計幫助臨床醫(yī)生快速實現(xiàn)常規(guī)免疫表型，CD4T細(xì)胞計數(shù)、DNA、網(wǎng)織紅細(xì)胞、

2、血小板等臨床分析，其更以其完美的三色分析功能成為遺傳、腫瘤、血液、免疫功能等諸多研究不可或缺的重要工具。,流式細(xì)胞儀特點,開灤醫(yī)院引進(jìn)的BD公司FACSCalibur流式細(xì)胞儀,BD LSR,FACSAria,流式細(xì)胞儀的工作原理,,信號檢測--散色光,它反應(yīng)細(xì)胞FSC（小角散射)光它反應(yīng)細(xì)胞的相對大小和截面積的大小SSC (90度角散射光)代表細(xì)胞的顆粒度和精細(xì)結(jié)構(gòu)的變化的物理特性,根據(jù)前側(cè)向散射光，可以把不同類型的細(xì)胞群加以區(qū)分

3、,信號檢測--熒光信號,,流式細(xì)胞術(shù)的操作流程,流式細(xì)胞儀檢測范圍,1 對細(xì)胞抗原的檢測,各種血細(xì)胞都有相應(yīng)的抗原表達(dá)方式，并且不同成熟階段表達(dá)的抗原種類也不完全相同。通過免疫熒光標(biāo)記技術(shù)將細(xì)胞表面抗原同標(biāo)記有特異染料的一種以上單克隆抗體結(jié)合后，在流式細(xì)胞儀同一激光光源激發(fā)下產(chǎn)生幾種特異熒光色，由熒光檢測器對每個細(xì)胞的體積、結(jié)構(gòu)、熒光種類及性質(zhì)等多種參數(shù)同時測定，分析得到細(xì)胞群體的多種表面抗原的表達(dá)情況。FCM也可用于特異性細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或細(xì)

4、胞核上抗原的檢測，并協(xié)同其他實驗指標(biāo)預(yù)示疾病的預(yù)后［2］ 。FCM也為網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)提供了快速、準(zhǔn)確的測試手段，可通過某些染料與網(wǎng)紅中RNA結(jié)合，在FCM測量時發(fā)出特定顏色的熒光，進(jìn)行單參數(shù)定量RNA。,2 對淋巴細(xì)胞及其亞群的分析,FCM進(jìn)行淋巴細(xì)胞及其亞群的分析，分類更客觀、準(zhǔn)確。使用流式細(xì)胞儀的絕對計數(shù)系統(tǒng)，即加入已知數(shù)量的熒光微球，通過儀器測定時收獲的細(xì)胞數(shù)量和微球數(shù)量及血液標(biāo)本用量，直接得到每微升全血中T淋巴細(xì)胞亞群的絕對計數(shù)

5、（個/μl）［3］ 。用FCM檢測PBMC中p24、p24nef、p18等HIV抗原陽性的CD4 + 細(xì)胞數(shù)可監(jiān)測體內(nèi)HIV復(fù)制情況，結(jié)果表明HIV抗原陽性細(xì)胞與CD4 + 細(xì)胞數(shù)量負(fù)相關(guān) ［4］ 。,T淋巴細(xì)胞檢測,,CD8+Ts淋巴細(xì)胞檢測,B淋巴細(xì)胞檢測,NK細(xì)胞檢測,3 白細(xì)胞分類分析,利用FCM的體積測定和細(xì)胞結(jié)構(gòu)測定來檢測每個白細(xì)胞的光散色強(qiáng)度，它與細(xì)胞體積、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞核形狀、細(xì)胞質(zhì)性狀等多種因素有關(guān)，經(jīng)過分析可得到中

6、性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的檢測結(jié)果。這種方法應(yīng)用于血細(xì)胞計數(shù)速度快、結(jié)果準(zhǔn)確，大大提高了臨床實驗室的工作效率 ［5］ 。,4 病毒抗原的檢測,FCM既可用于檢測受染細(xì)胞內(nèi)的病毒抗原，也可檢測受染細(xì)胞表面的病毒抗原。由于FCM檢測的是單個細(xì)胞，因此FCM檢測受染細(xì)胞適用于血液、支氣管灌洗液、尿標(biāo)本以及經(jīng)酶消化過的組織細(xì)胞。同時由于FCM為多參數(shù)分析，因此可在單個細(xì)胞中同時獲得多個分析參數(shù)并能定量檢出受染細(xì)胞。當(dāng)用不同熒光

7、染料標(biāo)記不同的病毒抗原特異性抗體或?qū)⑻禺愋圆《究贵w與不同大小的乳膠顆粒相聯(lián)時，F(xiàn)CM可同時檢測到同一樣本中的多種病毒或病毒抗原 ［6］ 。,5 病毒抗體檢測,利用吸附有病毒抗原的聚苯乙烯微球作為載體的病毒抗體FCM分析技術(shù)已廣泛應(yīng)用。結(jié)合流式細(xì)胞儀與微球雜交法可同步檢測同一反應(yīng)管中HIV、HCV、HBV的數(shù)目和種類，其基本原理為將檢測不同病原體的探針分別包被微球，流式細(xì)胞儀分辨特異性結(jié)合后發(fā)出的不同強(qiáng)度的熒光。當(dāng)用FCM技術(shù)檢測HCV核

8、心抗原、NS 3 抗原抗體時，其靈敏度比酶標(biāo)免疫技術(shù)高5倍左右 ［7］,6 在器官移植中的作用,FCM通過檢測受者血清中抗供者的抗HLA的抗體，根據(jù)抗體的種型、效價、靶抗原和器官移植的類型不同，抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)也有所不同，F(xiàn)CM比傳統(tǒng)方法更靈敏、操作時間更短并可同時檢測細(xì)胞亞型、分辨出IgG和IgM抗體。巨細(xì)胞病毒（CMV）能在白細(xì)胞內(nèi)繁殖并合成CMV特異性蛋白，通過FCM檢測CMV特異性抗原及其抗原分泌量，這種技術(shù)用于CMV感染檢測

9、時感染后4h便可檢出T淋巴母細(xì)胞中CMV-DNA，從而可快速、準(zhǔn)確地反映CMV在移植受者中的早期感染狀況，對預(yù)防和減少感染具有重要意義 ［8］ 。以FCM監(jiān)測腎移植受體CD8 + 、CD38 + 、T細(xì)胞亞群的變化也可監(jiān)測CMV感染 ［9］ 。,7 檢測血小板自身抗體,FCM檢測PAIgG與ELISA相比更簡便省時，檢測中操作步驟少。由于血小板被抗體-熒光素標(biāo)記而顯示陽性，所以不受其它種類細(xì)胞或碎片的影響，重復(fù)性好，可檢測成批或單個標(biāo)本

10、，可直觀地顯示結(jié)合PAIgG量不同的血小板群體，并可在同一份標(biāo)本上同時測定聚集和釋放功能 ［10］ 。,8 在白血病診斷中的作用,白血病是白細(xì)胞在分化到某個階段受阻后異常增殖的結(jié)果，利用白細(xì)胞分化不同階段出現(xiàn)的細(xì)胞表面標(biāo)志可以對白血病進(jìn)行免疫分型。過去對造血細(xì)胞和免疫細(xì)胞分類主要是依據(jù)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞免疫化學(xué)染色來進(jìn)行的，現(xiàn)在將多種檢測手段相結(jié)合，可為臨床診斷、治療監(jiān)測和預(yù)后提供更多、更有力的依據(jù)。通過FCM檢測各種急性白血病細(xì)胞表面抗

11、原的表達(dá)，對臨床診斷尤為重要 ［11］ 。,9 在腫瘤診斷中的作用,通過DNA含量分析的細(xì)胞周期分布，可反映腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)，對治療及預(yù)后有十分重要的意義。近年來，流式細(xì)胞測量法DNA分析越來越多地應(yīng)用于實體瘤患者。DNA非整倍體的出現(xiàn)率和癌變與不典型增生程度密切相關(guān)。DNA非整倍體可能是癌前病變發(fā)生早期癌變的一個早期指標(biāo) ［12］ 。,10 在微型生物學(xué)研究中的應(yīng)用,從現(xiàn)有的微型生物核糖體RNA序列出發(fā)，設(shè)計分類專用的核酸探針，它們

12、能與核糖體RNA分子一些區(qū)域互補(bǔ)，而這些RNA分子對于目標(biāo)分類群是唯一的，通過熒光標(biāo)記寡核苷酸鏈探針與細(xì)胞內(nèi)同源RNA序列結(jié)合，目標(biāo)種可被測出，它們的系統(tǒng)發(fā)育被確定。在這一研究中，通過原位雜交，用FCM確定雜交信號，可定量雜交信號強(qiáng)度，而細(xì)胞和特異探針雜交的平均熒光強(qiáng)度與細(xì)胞和非特異探針雜交平均熒光強(qiáng)度的比率，能計算和估測探針特異性和靈敏性。由此確定微型生物DNA含量與倍體水平 ［13］,11 用于抗生素敏感性試驗,近年來，F(xiàn)CM用于細(xì)

13、菌的藥敏效應(yīng)研究已有較大發(fā)展，F(xiàn)CM與熒光染料的聯(lián)合運用可判斷細(xì)菌活力和功能狀態(tài)，由于速度快，該方法已被建議用作臨床實驗室的常規(guī)藥敏試驗 ［14］。綜上所述，F(xiàn)CM具有快速、靈敏及能同時進(jìn)行多參數(shù)分析的優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于多種學(xué)科，具有廣闊的應(yīng)用前景。,目前的流式細(xì)胞儀應(yīng)用研究,1、2 345,癌癥患者外周血細(xì)胞DNA與T細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞活性關(guān)系的研究,白血病的分型,肝癌患者免疫性預(yù)后的研究,中西醫(yī)結(jié)合治療胰腺炎后外周血中T細(xì)

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