流式細胞儀技術(shù)課件

1、流式細胞術(shù)Flow Cytometry（FCM）,,概 述,流式細胞技術(shù)的發(fā)展1930s~1950s:開始出現(xiàn)自動細胞分析技術(shù)（細胞的計數(shù)，光電儀記錄流過一根毛細管的細胞,結(jié)合了熒光素的抗體去標(biāo)記細胞內(nèi)的特定蛋白，應(yīng)用分層鞘流原理，成功的設(shè)計紅細胞光學(xué)自動數(shù)器。） 1960s晚期發(fā)展：（熒光檢測細胞計 ，細胞分選器檢測細胞的熒光信號 ，單克隆抗體技術(shù) ，1973年，BD公司與美國斯坦福大學(xué)合作，研制開發(fā)并生產(chǎn)了世界第一臺商用

2、流式細胞儀FACS I。）儀器特點：單個細胞通過狹窄， 激光束產(chǎn)生能夠反映細胞大小的信號，激光束激發(fā)不同的熒光素所標(biāo)記的細胞成分能發(fā)射出不同的熒光。,流式細胞儀技術(shù)在醫(yī)學(xué)與生物學(xué)中的應(yīng)用,流式細胞術(shù)( Flow Cytometry, FCM) 是一種對細胞或亞細胞結(jié)構(gòu)進行快速測量及分選的技術(shù)。它利用高能量的激光照射高速流動的被熒光色素染色的單細胞（或微粒）,測量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強度，對細胞(或微粒) 的物理性狀、細胞的生理和

3、生化反應(yīng)、細胞免疫、血液病的診斷及治療、移植醫(yī)學(xué)、腫瘤細胞的增殖及凋亡、臨床病菌的檢驗等進行定性或定量檢測。在生物學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床診斷及治療等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。,FCM基本結(jié)構(gòu),1.激光, 光路系統(tǒng)及光電倍增管(探測器)2.液流系統(tǒng)3.計算機處理系統(tǒng),FCM結(jié)構(gòu)圖,,1. 激光, 光路系統(tǒng)及光電倍增管(探測器)原理示意圖,光學(xué)系統(tǒng) FCM的光學(xué)系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾光片、小孔組成，它們分別將不同波長的熒光信號送入到不同的電子探測

4、器。,2. 液流系統(tǒng),流動室,激光聚焦,激光波長: 488nm, 635nm,3.流式細胞儀工作原理,提 要,流式細胞儀使用的基本知識流式細胞儀檢測的生物學(xué)意義流式細胞儀檢測在臨床診斷的應(yīng)用,1 流式細胞儀使用的基本知識,前向散射光(FSC)與側(cè)向散射光(SSC)的含義熒光素的選擇檢測通道的確定自發(fā)熒光的產(chǎn)生消除非特異性結(jié)合-FcR阻斷對照的設(shè)置多色熒光補償?shù)恼{(diào)節(jié)設(shè)門的意義樣品處理的要求,FSC和SSC的原理,

5、前向散射光(FSC)與側(cè)向散射光(SSC)的含義,前向散射光,,側(cè)向散射光,血細胞雙參數(shù)點圖,,Fluorescein Isothiocyanate (FITC)異硫氰酸熒光素Phycoerythrin (PE)藻紅素Allophycocyanin (APC)異藻藍蛋白Peridinin-Chlorophyll Protein (PerCP)多甲藻黃素-葉綠素蛋白Tandem DyesPE-Texas Red (ECD

6、)PE-Cy5 (PC5)PE-Cy5.5 (PC5.5) (futures)PE-Cy7 (PC7) (futures)Propidium iodide（PI ）碘化丙碇,常用熒光染料(488nm,633nm激發(fā)),熒光素的選擇：熒光強度FITC<PE<APC依次增加；弱信號采用PE或APC，強信號采用FITC,熒光素的選擇,常用熒光染料的特性,熒光染料 激發(fā)波長 (nm) 發(fā)射波長(n

7、m) 用途 顏色FITC 488 525 免疫熒光 綠色PE(RD1) 488 575 免疫熒光

8、 橙色 PerCP 488 670 免疫熒光 紅色APC 633 670 免疫熒光 紅色PI 488 620

9、 DNA染色 橙紅ECD 488 620 免疫熒光 橙紅PeCy5 488 675

10、免疫熒光 紅色,通道 發(fā)射波長 熒光顏色FL1 530/30 綠色 FL2 585/42 橙色FL3

11、 650 橙紅FL4 661/16 紅色FL2 - Area FL2 - Width,檢測通道的確定,自發(fā)熒光的產(chǎn)生,末染色的細胞受到光照射后所發(fā)出的熒光稱自發(fā)熒光。用流式細胞計測定細胞的特異性熒光染料的熒光時，這種自發(fā)熒光對所欲測定的特異性

12、熒光是一種本底信號，自發(fā)熒光在多種情況下都會干擾特異性熒光信號，尤其是對低水平結(jié)合的熒光抗體它能減低染色的和未染色的細胞間的區(qū)別，使我們難以確定細胞中熒光信號的水平。自發(fā)熒光的強弱與細胞的大小、細胞的類型、激發(fā)光的波長、發(fā)射光的檢測范圍等都有關(guān)系。產(chǎn)生自發(fā)熒光的分子可能是正常細胞的組成成分如核黃素、細胞色素等。,消除非特異性結(jié)合-FcR阻斷,對于小鼠細胞需要用于FcR阻斷劑(純化的抗Fc?II/III受體抗體)減少非特異性熒光染色；對

13、于人和兔細胞可以應(yīng)用純化同種的Ig或血清預(yù)先阻斷Fc受體,對照的設(shè)置,細胞固定和膜穿透后，應(yīng)用同一克隆的無熒光素結(jié)合抗體處理，能夠區(qū)分細胞因子特異和非特異染色熒光素結(jié)合的Isotype Ig作為陰性對照，陰性對照的抗體濃度應(yīng)該與抗細胞因子抗體的濃度相同；細胞內(nèi)細胞因子檢測,可設(shè)陽性對照細胞。,激發(fā)光源與熒光標(biāo)記物示意圖,光譜重疊示意圖,熒光補償,流式細胞儀常用的熒光染料多數(shù)存在發(fā)射光譜的重疊，流式細胞儀的光學(xué)濾片系統(tǒng)最大限度地減少這

14、些信號。色彩補償(Color Compensation):利用電子或數(shù)學(xué)方法從一個信號減少另外一個信號成分的技術(shù)，典型例子是校對一個波長區(qū)域的熒光信號在垂直軸的第二熒光的重疊。,光譜重疊的校正的示意圖,多色熒光補償?shù)恼{(diào)節(jié),兩種發(fā)射熒光重疊的部分利用熒光(色彩)補償調(diào)節(jié)來消除。 色彩補償(Color Compensation):利用電子或數(shù)學(xué)方法從一個信號減少另外一個信號成分的技術(shù)，是校對一個波長區(qū)域的熒光信號在垂直軸的第二熒

15、光的重疊。,設(shè)門的意義,細胞類型或亞型的鑒定特殊蛋白質(zhì)的分析細胞的分選,細胞分選前后示意圖,標(biāo)本來源:外周血、骨髓、培養(yǎng)細胞、組織(經(jīng)尼龍網(wǎng)300目過濾) 制成單細胞懸液標(biāo)本濃度：106/ml-外周血白細胞計數(shù)，白血病人血標(biāo)本需PBS稀釋抗凝劑：EDTA、肝素-若抗凝不佳，有凝塊，則不可檢測。溶血劑：保持細胞形態(tài)、紅細胞裂解完全。反應(yīng)溫度：26～27ºC，室溫避光。細胞處理：,樣品處理的要求,細胞處理：

16、細胞固定和膜通透,抗體滴度,檢測細胞內(nèi)的細胞因子表達，細胞必須在穿透細胞膜前被固定，以維持細胞的結(jié)構(gòu)完整性；細胞固定選用70%乙醇 4%(w/v) paraformaldehyde（中性pH, PBS緩沖液);細胞穿透選用去污劑0.2%Triton X-100;應(yīng)用抗體標(biāo)記的緩沖液含代謝抑制劑疊氮鈉(0.09%w/v)，抑制抗體結(jié)合引起的細胞膜蛋白的再分布由于熒光素結(jié)合抗體容易產(chǎn)生高水平的非特異背景信號，最好預(yù)先測定最佳抗體濃度

17、，否則存在假陽性,流式細胞儀檢測的生物學(xué)意義,免疫細胞的鑒定及表型分析細胞表面蛋白質(zhì)及細胞內(nèi)因子含量的測定細胞周期的分析,免疫細胞的鑒定及表型分析,免疫表型：利用熒光染料標(biāo)記抗體識別細胞抗原 ，識別細胞亞群的標(biāo)志。,白細胞簇分化抗原(Cluster Differentiation Antigen，CD)系統(tǒng),1984年首屆國際人類白細胞分化抗原會，對T細胞分化抗原命名，建立了CD命名系統(tǒng)。利用抗原相應(yīng)的單克隆抗體結(jié)合的熒光染料，識

18、別組織細胞上不同的CD分子。,NK細胞和T淋巴細胞亞群,Th1和Th2細胞,細胞表面蛋白質(zhì)及細胞內(nèi)因子含量的測定,細胞周期的分析,,食管癌細胞株的細胞周期,流式細胞儀檢測在臨床診斷的應(yīng)用,在臨床細胞免疫學(xué)中的應(yīng)用在臨床血液學(xué)中的應(yīng)用 在臨床腫瘤學(xué)中的應(yīng)用,FCM在臨床細胞免疫學(xué)中的應(yīng)用,淋巴細胞表面標(biāo)志的檢測 淋巴細胞分為：T 淋巴細胞和 B 淋巴細胞，T 淋巴細胞免疫標(biāo)志為 CD3、CD4、CD8 ,

19、 B 淋巴細胞免疫標(biāo)志是 CD19 , 自然殺傷（NK)細胞免疫標(biāo)志(CD16、CD56) , 記憶 T 細胞主要免疫標(biāo)志(CD4、CD45RO) , 天然T 細胞主要免疫標(biāo)志( CD4、CD45RA) , 調(diào)節(jié)性T細胞主要免疫標(biāo)志(CD4、CD25) , 樹突狀細胞主要免疫標(biāo)志( CD11c、CD123) 。通過FCM對淋巴細胞免疫表型的分析,不僅能了解淋巴細胞的分化及其功能,鑒別新的淋巴細胞亞群,而且通過研究大多數(shù)疾病的特異性

20、淋巴細胞亞群或某些細胞表面標(biāo)志的存在、缺乏、過度表達等,對免疫性疾病、感染、腫瘤等疾病的診斷和治療，免疫功能的重建和器官移植等均有重要的臨床意義。,T淋巴細胞的Th和Ts細胞亞群,NK細胞和B淋巴細胞亞群,細胞內(nèi)細胞因子的測定 檢測細胞因子對于臨床上某些疾病的診斷和治療具有重要的意義。其方法主要是通過細胞因子的特異性單克隆抗體進行細胞內(nèi)免疫熒光染色,并結(jié)合膜表面抗原染色, 用多重染色FCM分析各種細胞

21、內(nèi)合成的細胞因子, 并根據(jù)各類細胞所產(chǎn)生的細胞因子種類的差別, 對免疫細胞進行分類, 如輔助性T細胞(Th1、Th2) 。因此，F(xiàn)CM 對活化免疫細胞內(nèi)的細胞因子的檢測，不僅能分析細胞因子的含量和產(chǎn)生細胞因子的不同細胞亞群,還能了解細胞內(nèi)細胞因子產(chǎn)生的動力學(xué)機制。,細胞內(nèi)細胞因子的意義,細胞因子決定免疫效應(yīng)細胞的構(gòu)成和形成介導(dǎo)免疫功能的轉(zhuǎn)化(保護性免疫和對病原體的炎癥反應(yīng))任何異常調(diào)節(jié)形式將導(dǎo)致免疫病理狀態(tài)：免疫缺陷或自身免疫在健

22、康和疾病中起非常重要作用，是臨床和基礎(chǔ)研究的重點,Th1/Th2細胞的檢測及應(yīng)用,一系列表達細胞因子的特定細胞群：T、B、NK和單核巨噬細胞系統(tǒng)；I型細胞涉及細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，遲發(fā)過敏反應(yīng)、巨噬細胞活化、下調(diào)II型反應(yīng)，病毒、某些細菌刺激；II型細胞涉及體液免疫反應(yīng)，B細胞增生、多克隆Ig分泌、下調(diào)I型反應(yīng)，原蟲、過敏原刺激。,FCM在臨床血液學(xué)中的應(yīng)用,血細胞的來源血液疾病的檢測造血干細胞檢測,急性B淋巴細胞性白血病,血液疾

23、病的檢測,CD34+CD19+CD33-CD13-,CD34+CD33+CD13+型粒細胞性白血病,造血干細胞檢測,造血干細胞移植是目前治療白血病和其它惡性腫瘤及遺傳性疾病的有效方法之一造血干細胞的來源：骨髓、動員的外周血單個核細胞、臍帶血等目前采用的造血干細胞檢測包括：CFU-GM、CFU-G等功能檢測；CD34細胞計數(shù)。CD34抗原是85年代中期發(fā)現(xiàn)的細胞膜分子，存在于幼稚造血干細胞和所有集落形成單位細胞膜上，包括定向和多能祖

24、細胞CD34+細胞占正常骨髓單個核細胞群體的1~4%外周血小于0.1%增強測定CD34+細胞的數(shù)量對造血干細胞移植非常重要CD34+的定量分析應(yīng)用于動員過程、外周血白細胞分離過程中和分離后的監(jiān)測。,細胞處理,CD34+陽性細胞絕對計數(shù),對于微量細胞的分析，去除背景信號或細胞碎片非常重要利用核酸染料(FL-1)能夠識別完全的有核細胞，如白細胞和有核紅細胞；去除細胞碎片、成熟紅細胞、血小板 造血祖細胞CD45弱陽性，利用CD45

25、-PerCP/SSC去除淋巴細胞、單核細胞、粒細胞、死細胞、細胞碎片、聚集血小板和有核紅細胞CD34-PE抗體標(biāo)記造血祖細胞IgG1-PE作為陰性對照,左圖根據(jù)核酸染料(FL1)去除細胞碎片確定祖細胞位置中圖依據(jù)CD45染色(FL3)減少CD45強陽性細胞；同時根據(jù)SSC去除非祖細胞的高SSC細胞；右圖顯示R1和R2區(qū)的細胞及R3的標(biāo)準珠；通過FL1/FL2清晰區(qū)分出CD34+細胞群；根據(jù)R3區(qū)的數(shù)量計算CD34+細胞的絕對

26、數(shù)。 R4÷R3×51700÷50ul,FCM在臨床腫瘤學(xué)中的應(yīng)用,利用FCM檢測染有碘化丙啶（Propidium iodide，PI）的細胞，對腫瘤細胞DNA含量作出定量分析,通過研究細胞的周期變化及細胞異倍體的測定,預(yù)測各種腫瘤治療的預(yù)后；在腫瘤化療中對藥物的選擇，及放療中對強度、時間的決定等起著指導(dǎo)作用；解釋抗癌藥物的作用機制；對癌癥進行早期診斷及鑒別良惡性有一定的參考價值。而且，F(xiàn)CM 對細胞凋亡、

27、抗凋亡蛋白質(zhì)、周期蛋白、癌基因、抗癌基因的研究，均可揭示腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機制；并對腫瘤預(yù)防、治療和預(yù)后的評價等方面起著重要的作用。,凋亡細胞,特性：① 細胞內(nèi)的內(nèi)切核酸酶的激活，導(dǎo)致細胞中低分子量DNA的出現(xiàn),進而減少了DNA的特異的熒光染色。② 凋亡的細胞具有完整的細胞膜，對碘化丙啶（Propidium iodide，PI）染料具有排斥反應(yīng)。③ 早期的細胞凋亡表現(xiàn)為細胞膜的不對稱的丟失，即磷脂絲氨酸殘基在質(zhì)膜內(nèi)外層分布的改變。利用一種

28、抗凝結(jié)蛋白（Annexin V，既能優(yōu)先與負離子的磷脂如磷脂酰絲氨酸結(jié)合，又能與熒光染料結(jié)合）的親合性進行檢測。,凋亡細胞流式細胞儀的分析方法,Annexin Ⅴ分析PI染色分析DNA斷片的分析,,Annexin Ⅴ分析原理,,,Annexin Ⅴ分析圖,PI 染色原理,PI(碘化丙啶,Propidium iodide)是一種插 入性的熒光染料，能夠嵌入雙鏈核酸（DNA和RNA）的堿基對中，經(jīng)RNA酶的處理后，細胞中的RNA被消化掉