干擾高爾基體蛋白73(GP73)表達對肝癌細胞HepG2增殖的影響.pdf

1、目的：
　　 GP73作為新發(fā)現(xiàn)的在肝癌組織和血清中表達異常增加的高爾基體定位蛋白，其功能尚不明確，僅知道它與某些腫瘤如肝癌等密切相關(guān)，且推測其可能對肝癌細胞高爾基體結(jié)構(gòu)和功能的維持具有重要作用，但仍需要進一步研究。因此，本實驗擬從改變GP73表達對肝癌細胞增殖的影響的角度去研究GP73在肝癌中的生物學(xué)功能。
　　 方法：
　　 1.采用Western-blotting方法檢測GP73蛋白在各種細胞株中的表達水平

2、，選定肝癌細胞株HepG2作為我們的研究載體細胞。
　　 2.我們設(shè)計GP73特異的siRNA，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染肝癌細胞株HepG2，收集細胞總蛋白，Western-blotting法檢測GP73蛋白表達水平的變化，確定干擾片段的干擾效果。
　　 3.使用GP73siRNA轉(zhuǎn)染H印G2細胞，MTT法分別在轉(zhuǎn)染后0h、24h、48h和72h檢測其細胞活力，觀察細胞增殖速率的變化；轉(zhuǎn)染后60h加Nocodazole阻滯12h，收

3、集細胞，PI染色細胞核DNA，流式細胞儀檢測其DNA含量，計算細胞周期各時相比例的變化；轉(zhuǎn)染后72h，收集細胞，AnnexinV/PI雙標(biāo)記染色，流式細胞儀檢測兩種染料的熒光強度，計算細胞凋亡的變化。通過以上實驗初步觀察GP73蛋白對肝癌細胞增殖的影響。
　　 4.進一步探索以上現(xiàn)象的分子機制。利用相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白p-ERK、p-JNK、p-c-jun、p-Rb、p-CDK4、p-CDK6、CDK4、CDK6、cyclinD

4、3等的特異性抗體，Western-blotting法檢測其蛋白的表達變化，深入研究GP73在肝癌細胞中發(fā)揮生物學(xué)功能的具體機制。
　　 結(jié)果：
　　 1.本實驗設(shè)計的GP73干擾片段siRNA對HepG2細胞中GP73蛋白的表達具有明顯的抑制作用；
　　 2.降低HepG2細胞中GP73蛋白表達可導(dǎo)致細胞增殖抑制；
　　 3.降低HepG2細胞中GP73蛋白表達可導(dǎo)致細胞周期阻滯于G1期；