雜色曲霉素誘導(dǎo)人胃黏膜上皮細胞(GES-1)G2期阻滯及凋亡可能分子機制的研究.pdf

1、雜色曲霉素(sterigmatocystin，ST)是雜色曲霉、構(gòu)巢曲霉等曲霉菌屬真菌所產(chǎn)生的一種低分子量毒性代謝產(chǎn)物，廣泛存在于自然界，是人類和動物食物中最常見的污染物之一。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，ST具有致癌性、致突變性和免疫毒性等生物學(xué)效應(yīng)。同時，ST可以對很多實驗動物的臟器造成急性毒性損傷，并且具有種屬及器官特異性。在短期實驗中，ST的遺傳毒性表現(xiàn)為可以直接造成細胞DNA損傷，與DNA形成加合物，還能引起染色體畸變，姐妹染色單體互換等。

2、在長期實驗中，ST可誘導(dǎo)實驗動物發(fā)生肝癌、肺癌、間皮瘤等腫瘤。ST已被國際癌癥研究中心列為“可能的人類致癌物”。本室前期研究發(fā)現(xiàn)，ST可誘發(fā)體外培養(yǎng)人胚胃黏膜細胞增殖活躍及抑癌基因p53的突變、過表達；長期灌胃ST可以引起小鼠腺胃黏膜的腸上皮化生和腺上皮不典型增生。ST是我國河北省南部胃癌、食管癌高發(fā)區(qū)糧食中最常見的霉菌毒素污染物之一。大量的腫瘤病因流行病學(xué)研究表明，ST的飲食暴露可能與該區(qū)域胃癌高發(fā)有關(guān)。因此，深入研究ST對人胃粘膜上

3、皮細胞的細胞毒性作用，可為進一步探討ST的可能致癌機制提供必要的實驗依據(jù)，且具有重要的現(xiàn)實意義。
　　 細胞增殖與死亡之間的失衡常被認為是腫瘤發(fā)生過程中的重要環(huán)節(jié)。當外界刺激因素引起細胞DNA損傷時，將通過啟動檢測點機制而誘導(dǎo)細胞發(fā)生周期阻滯，這使得細胞有充足的時間修復(fù)受損DNA，但修復(fù)失敗的細胞則被誘導(dǎo)發(fā)生凋亡。這一過程對于維持基因組的穩(wěn)定性具有重要意。檢測點調(diào)控紊亂引起的細胞周期和凋亡異?？赡軐?dǎo)致細胞基因組失穩(wěn)、基因突變和D

4、NA異倍體出現(xiàn)，甚至發(fā)生癌變。研究表明，很多致癌性毒素的早期效應(yīng)多是誘發(fā)細胞周期紊亂、增殖抑制及凋亡異常等。謝同欣等發(fā)現(xiàn)，ST可誘導(dǎo)小鼠胚胎纖維母細胞細G2/M期阻滯及p53蛋白表達上調(diào)。本室也證實，ST作用于人胃粘膜上皮細胞24小時可通過影響MAPK通路而誘導(dǎo)其發(fā)生G2期阻滯。
　　 DNA損傷檢測點信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是一個高度保守的信號感應(yīng)過程。ATM/ATR是能早期感應(yīng)DNA損傷信號的蛋白激酶，其活性的增加構(gòu)成了整個途徑活化的第

5、一步，p53是ATM的底物之一，它能夠根據(jù)損傷的嚴重程度，或激活細胞周期檢測點，誘導(dǎo)周期阻滯從而修復(fù)DNA，或啟動細胞進入凋亡途徑。
　　 為進一步闡明ST的細胞毒性作用及可能機制，本研究以永生化人正常胃黏膜上皮細胞(GES-1)為研究對象，初步探討了ST的致?lián)p傷作用及其相關(guān)機制。我們首先觀察了ST較長期作用對GES-1細胞周期進程以及細胞增殖與凋亡的影響；接下來檢測了ST對GES-1細胞DNA的損傷作用及其下游可能的損傷信號傳

6、導(dǎo)途徑；最后以同時與DNA損傷和細胞周期阻滯、凋亡密切相關(guān)的p53-p21WAF1/CIP1信號通路為研究靶點，深入探討了ST誘導(dǎo)GES-1細胞G2期阻滯及凋亡的分子機制。為揭示ST飲食暴露與人胃黏膜損傷乃至胃癌發(fā)生的可能關(guān)系奠定實驗基礎(chǔ)，對提高我國胃癌高發(fā)區(qū)居民食品安全水平具有重要意義。
　　 本研究論文共分為三個部分：
　　 第一部分、雜色曲霉素對GES-1細胞增殖和凋亡的影響
　　 目的：探討雜色曲霉素對體

7、外培養(yǎng)的人胃黏膜上皮細胞(GES-1)細胞周期分布以及細胞增殖與凋亡的影響。
　　 方法：采用噻唑藍(MTT)比色法觀察不同濃度(0.03～48μM)ST作用24、48及72h對GES-1細胞存活率的影響。流式細胞定量檢測(FCM)不同時間(2～12d)及不同濃度(0.075～3μM)ST處理后GES-1細胞周期分布情況。蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶聯(lián)反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測ST處理后G2/M期關(guān)

8、鍵調(diào)節(jié)分子-Cdc25C、Cdc2和CyclinB1在蛋白水平和mRNA水平上的表達情況。免疫共沉淀技術(shù)檢測Cdc2-CyclinB1復(fù)合物的形成情況。PI單染法和annexin V-PI雙染法檢測ST對GES-1細胞凋亡的影響。Hoechst33258染色從形態(tài)上檢測ST對GES-1細胞凋亡的的影響。Western Blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bxl-2、Bax和NF-κB的表達變化及Caspase-3的激活情況。
　　 結(jié)果：<

9、br>　　 1.1 ST對GES-1細胞存活率的影響
　　 MTT法檢測結(jié)果顯示，ST處理24h，3～48μM濃度范圍的ST處理組GES-1細胞存活率均較溶劑對照組明顯降低(P＜0.05），且呈劑量依賴性(r24h=-0.961，P＜0.01);ST處理48及72h，在1.5～48μM濃度范圍內(nèi)，各ST處理組細胞存活率分別明顯低于各自相應(yīng)的溶劑對照組(P＜0.05），且呈劑量依賴性(r48h=-0.955，r72h=-0.91

10、3，P＜0.01)。在24μM和48μM兩個ST處理濃度，隨著ST作用時間的延長GES-1細胞的存活率均明顯降低，呈時間依賴性(r24μM=-0.998，r48μM=-0.998，P＜0.05)。提示ST對GES-1細胞的生長有明顯的抑制作用，且呈時間、劑量依賴地方式。
　　 1.2 ST對GES-1細胞周期分布的影響
　　 1.2.1 ST作用不同時間對GES-1細胞周期及其關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的影響
　　 1.2.1

11、.1 ST作用不同時間對GES-1細胞周期分布的影響
　　 FCM檢測結(jié)果表明，3μM ST2d、4d、8d及12d處理組細胞G2/M期細胞比例明顯增加(P＜0.05)，且隨著ST作用時間的延長，G2/M期細胞比例先增高后降低，峰值出現(xiàn)在ST作用后第4天(P＜0.05)。
　　 1.2.1.2 ST作用不同時間對GES-1細胞G2期關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的影響
　　 Western Blot結(jié)果顯示，3μM ST處理2d、

12、4d、8d及12d可以降低GES-1細胞內(nèi)Cdc25C的去磷酸化水平（P＜0.05）和升高其磷酸化水平(P＜0.05），并且分別呈時間依賴性(r=-0.814，r=0.807，P＜0.01)。各ST不同時間處理組GES-1細胞Cdc25C在mRNA水平上的表達明顯低于對照組（P＜0.05）。
　　 Western Blot結(jié)果顯示，3μM ST2d、4d處理組細胞Cdc2蛋白水平較對照組明顯降低(P＜0.05），但ST8d及12

13、d處理組又逐漸恢復(fù)至對照組水平。各不同時間處理組Cdc2的磷酸化水平較對照組有明顯升高(P＜0.05），且呈時間依賴性(r=0.603，P＜0.01)。各處理組GES-1細胞Cdc2的mRNA表達量均明顯低于溶劑對照組(P＜0.05)。
　　 Western Blot結(jié)果顯示，3μM ST2d、4d、8d及12d處理組CyclinB1蛋白表達水平均較對照組明顯升高（P＜0.05）。各處理組GES-1細胞CyclinB1的mRNA

14、表達量均明顯高于溶劑對照組(P＜0.05)。
　　 1.2.2不同濃度ST對GES-1細胞周期及其關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的影響
　　 1.2.2.1不同濃度ST作用4天對GES-1細胞周期及其關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的影響
　　 1.2.2.1.1不同濃度ST作用4天對GES-1細胞周期分布的影響
　　 FCM檢測結(jié)果表明，ST處理4天后，0.3μM、1.5μM、3μM ST處理組G2/M期細胞比例均較溶劑對照組明顯增加(P＜

15、0.05)，并且在0～3μM濃度范圍內(nèi)，G2/M期細胞比例與ST的處理濃度呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.927，P＜0.01)。
　　 1.2.2.1.2不同濃度ST作用4天對GES-1細胞G2期關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的影響
　　 Western Blot結(jié)果顯示，ST作用4天后，0.3μM、1.5μM和3μM ST處理組細胞的Cdc25C和Cdc2蛋白表達水平較溶劑對照組明顯減少(P＜0.05)，且分別呈劑量依賴性(r=-0.800，r

16、=-0.876，P＜0.01)；而Cdc25C和Cdc2的磷酸化水平則較溶劑對照組明顯增加(P＜0.05），且呈劑量依賴性(r=0.714，r=0.767，P＜0.01)。各處理組Cdc25C和Cdc2的mRNA表達量均明顯低于溶劑對照組(P＜0.05)。
　　 Western Blot結(jié)果顯示，ST作用4天后，0.3μM、1.5μM和3μM ST處理組細胞的Cyclin B1蛋白表達水平較溶劑對照組明顯增加(P＜0.05)，且

17、呈劑量依賴性(r=0.929，P＜0.01)。
　　 1.2.2.1.3不同濃度ST作用4天對GES-1細胞Cdc2-CyclinB1復(fù)合物的影響
　　 免疫共沉淀結(jié)果顯示，ST作用4天后，Cdc2和CyclinB1可以以復(fù)合物的形式存在，0.075μM、0.3μM、1.5μM和3μM ST處理4天可以減少Cdc2-CyclinB1復(fù)合物的形成。
　　 1.2.2.2不同濃度ST作用8天對GES-1細胞周期及其關(guān)

18、鍵調(diào)節(jié)因子的影響
　　 1.2.2.2.1不同濃度ST作用8天對GES-1細胞周期分布的影響
　　 FCM檢測結(jié)果表明，ST處理8天后，0.3μM、1.5μM、3μM ST處理組G2/M期細胞比例均較溶劑對照組明顯增加(P＜0.05），并且在0～3μM濃度范圍內(nèi)，G2/M期細胞比例與ST的處理濃度呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.910，P＜0.01)。
　　 1.2.2.2.2不同濃度ST作用8天對GES-1細胞G2期關(guān)鍵

19、調(diào)節(jié)因子的影響
　　 Western Blot結(jié)果顯示，不同濃度ST作用于GES-1細胞8天后，1.5μM和3μM ST處理組細胞的Cdc25C蛋白表達水平較溶劑對照組明顯減少（P＜0.05），且在ST0.3～3μM的濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性(r=-0.830，P＜0.01)；而Cdc25C的磷酸化水平則較溶劑對照組明顯增加(P＜0.01)，且在ST0.3～3μM的濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性(r=0.752，P＜0.01)。各處理組C

20、dc25C的mRNA表達量均明顯低于溶劑對照組(P＜0.05)。
　　 Western Blot結(jié)果顯示，不同濃度ST處理細胞8天后，各濃度處理組中只有3μM ST處理組細胞的Cdc2蛋白表達水平較溶劑對照組下降(P＜0.05）；但各濃度處理組Cdc2的磷酸化水平均較溶劑對照組明顯增加（P＜0.05），且呈劑量依賴性（r=0.781，P＜0.01）。各處理組Cdc2的mRNA表達量均明顯低于溶劑對照組(P＜0.05）。
　

21、　 Western Blot結(jié)果顯示，不同濃度ST處理細胞8天后，0.3μM、1.5μM和3μM ST處理組細胞的Cyclin B1蛋白表達水平較溶劑對照組明顯增加(P＜0.05)，且在ST0.3～3μM的濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性(r=0.753，P＜0.01)。各濃度處理組GES-1細胞CyclinB1的mRNA表達量均明顯高于溶劑對照組(P＜0.05)。
　　 1.3 ST對GES-1細胞凋亡的影響
　　 1.3.1

22、 ST作用不同時間對GES-1細胞凋亡的影響
　　 1.3.1.1 ST作用不同時間對GES-1細胞凋亡率的影響
　　 PI單染法檢測細胞凋亡率，結(jié)果表明，GES-1細胞經(jīng)3μM ST處理2d、4d、8d及12d后，各ST處理組細胞凋亡率分別為3.11±0.69％，4.07±0.71％，7.96±1.17％及3.89±0.28％，其中ST4d、8d及12d處理組細胞的凋亡率均高于溶劑對照組2.19±0.08％(P＜0.0

23、5)，并且細胞凋亡的高峰出現(xiàn)在ST處理后第8天，12天又有明顯下降(P＜0.01)。表明3μM ST可以誘導(dǎo)GES-1細胞發(fā)生凋亡，且凋亡的高峰期出現(xiàn)在ST處理后8天，此時間晚于ST誘導(dǎo)的G2期阻滯的高峰期4天。提示ST作用于GES-1細胞時凋亡的發(fā)生晚于其誘導(dǎo)的G2期阻滯。
　　 1.3.1.2 Hoechst33258染色檢測ST作用不同時間GES-1細胞凋亡情況
　　 3μM ST ST處理GES-1細胞經(jīng)Hoec

24、hst33258染色后，熒光顯微鏡下觀察可見細胞核染色質(zhì)凝集、固縮，或核碎裂呈碎塊狀，顏色呈致密濃染的亮藍色。ST作用2至8天隨著ST作用時間的延長，凋亡指數(shù)(AI，％)逐漸升高(r=0.827，P＜0.01，F(xiàn)ig.12B)，至8天達最大值，12天又有所下降(P＜0.05)。
　　 1.3.1.3 ST作用不同時間對GES-1細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響
　　 1.3.1.3.1 ST作用不同時間對GES-1細胞Bcl-

25、2表達的影響
　　 Western Blot結(jié)果顯示，3μM ST作用2d、4d、8d及12d后，細胞的Bcl-2蛋白表達水平分別較溶劑對照組明顯降低(P＜0.05)，且其表達量隨著ST作用時間的延長而減少(r=-0.557，P＜0.05)。提示ST處理可以時間依賴性地下調(diào)GES-1細胞內(nèi)Bcl-2蛋白的表達。
　　 1.3.1.3.2 ST作用不同時間對GES-1細胞Bax表達的影響
　　 Western Bl

26、ot結(jié)果顯示，3μM ST作用2d、4d、8d及12d后，細胞的Bax蛋白表達水平分別較溶劑對照組明顯升高（P＜0.05），且其表達量在8d達高峰后，12天又有明顯下降(P＜0.05)。提示ST處理GES-1細胞可以上調(diào)Bax蛋白的表達，且表達量的峰值出現(xiàn)在ST處理后8天，與細胞凋亡的高峰時間一致。
　　 1.3.1.3.3 ST作用不同時間對GES-1細胞NF-κB表達的影響
　　 Western Blot結(jié)果顯示，3

27、μM ST作用2d、4d、8d及12d后，細胞的NF-κB蛋白表達水平分別較溶劑對照組明顯下降（P＜0.05），且其表達量隨著ST作用時間的延長而減少（r=-0.825，P＜0.01）。提示ST處理可以時間依賴性地下調(diào)GES-1細胞內(nèi)NF-κB蛋白的表達。
　　 1.3.1.3.4 ST作用不同時間對Caspase-3蛋白表達的影響
　　 Western Blot結(jié)果顯示，3μM ST2d、4d、8d及12d處理組均出現(xiàn)

28、了Caspase-3的活性片段，且隨ST處理作用時間的延長，陽性條帶顏色逐漸加深(P＜0.05)，并在ST處理8d時表達量達到峰值，之后12 d又有明顯的下降（P＜0.05）。表明ST處理可以激活GES-1細胞Caspase-3，且其活性片段表達水平的變化與ST處理后細胞凋亡率的變化趨勢一致。
　　 1.3.2不同濃度ST對GES-1細胞凋亡的影響
　　 1.3.2.1不同濃度ST作用4天對GES-1細胞凋亡的影響

29、>　　 1.3.2.1.1不同濃度ST作用4天對GES-1細胞凋亡率的影響
　　 PI單染法檢測細胞凋亡率，結(jié)果表明，GES-1細胞經(jīng)不同濃度ST處理4d后，0.075μM、0.3μM、1.5μM和3Mm ST處理組細胞凋亡率明顯高于溶劑對照組(P＜0.05），且隨濃度的增加凋亡率逐漸升高(r=0.854，P＜0.01)。
　　 進一步應(yīng)用Annexin V/PI雙染法檢測凋亡率，結(jié)果表明，不同濃度ST處理4天后GES

30、-1細胞早期和晚期凋亡率都較溶劑對照組顯著升高（P＜0.05），并且早期和晚期凋亡率之和也相應(yīng)增加(P＜0.05），與PI單染法結(jié)果一致。
　　 綜合以上兩種方法表明，ST作用4天可以劑量依賴性地誘導(dǎo)體GES-1細胞發(fā)生凋亡。
　　 1.3.2.1.2不同濃度ST作用4天對GES-1細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響
　　 1.3.2.1.2.1不同濃度ST作用4天對GES-1細胞Bcl-2表達的影響
　　 We

31、stern Blot結(jié)果顯示，ST作用4天后，0.075μM、0.3μM、1.5μM和3μM ST處理組細胞的Bcl-2蛋白表達水平較溶劑對照組明顯降低(P＜0.05)，且其表達量隨著ST濃度的增加而減少(r=-0.857，P＜0.05)。提示ST處理4天可以劑量依賴性地下調(diào)GES-1細胞內(nèi)Bcl-2蛋白的表達。
　　 1.3.2.1.2.2不同濃度ST作用4天對GES-1細胞Bax表達的影響
　　 Western Bl

32、ot結(jié)果顯示，ST作用4天后，0.075～3μM ST處理組細胞的Bax蛋白表達水平較溶劑對照組明顯升高(P＜0.05)，且其表達量隨著ST濃度的增加而升高(r=0.907，P＜0.01)。提示ST處理4天可以劑量依賴性地上調(diào)GES-1細胞內(nèi)Bax蛋白的表達。
　　 1.3.2.1.2.3不同濃度ST作用4天對GES-1細胞NF-κB表達的影響
　　 Western Blot結(jié)果顯示，ST作用4天后，0.3μM、1.5μ

33、M和3μM ST處理組細胞的NF-κB蛋白表達水平較溶劑對照組明顯下降（P＜0.05），且其表達量隨著ST濃度的增加而減少(r=-0.828，P＜0.01)。提示ST處理4天可以劑量依賴性地下調(diào)GES-1細胞內(nèi)NF-κB蛋白的表達。
　　 1.3.2.1.2.4不同濃度ST作用4天對Caspase-3蛋白表達的影響
　　 Western Blot結(jié)果顯示，ST作用4天后，各濃度ST處理組Caspase-3活性片段都較溶劑

34、對照組明顯增加(P＜0.01），且隨ST濃度增加陽性酶切片段的表達量逐漸升高(r=0.905，P＜0.05)。表明ST處理4天可以激活GES-1細胞Caspase-3，且其活性片段表達水平以劑量依賴方式增加。
　　 1.3.2.2不同濃度ST作用8天對GES-1細胞凋亡的影響
　　 1.3.2.2.1不同濃度ST作用8天對GES-1細胞凋亡率的影響
　　 PI單染法檢測細胞凋亡率，結(jié)果表明，GES-1細胞經(jīng)不同濃

35、度ST處理8d后，0.3μM、1.5μM和3μM ST處理組細胞凋亡率均明顯高于溶劑對照組（P＜0.05），且隨濃度的增加凋亡率逐漸升高(r=0.933，P＜0.01)。提示ST作用8天可以劑量依賴性地誘導(dǎo)體外培養(yǎng)人胃黏膜上皮細胞GES-1發(fā)生細胞凋亡。
　　 1.3.2.2.2不同濃度ST作用8天對GES-1細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響
　　 1.3.2.2.2.1不同濃度ST作用8天對GES-1細胞Bcl-2表達的影響

36、
　　 Western Blot結(jié)果顯示，ST作用8天后，0.3μM、1.5μM和3μM ST處理組細胞的Bcl-2蛋白表達水平較溶劑對照組明顯降低（P＜0.05），且其表達量隨著ST濃度的增加而減少(r=-0.912，P＜0.05)。提示ST處理8天可以劑量依賴性地下調(diào)GES-1細胞內(nèi)Bcl-2蛋白的表達。
　　 1.3.2.2.2.2不同濃度ST作用8天對GES-1細胞Bax表達的影響
　　 Western

37、Blot結(jié)果顯示，ST作用8天后，0.3μM、1.5μM和3μM ST處理組細胞的Bax蛋白表達水平較溶劑對照組明顯升高（P＜0.05），且其表達量隨著ST濃度的增加而升高(r=0.901，P＜0.01)。提示ST處理8天可以劑量依賴性地上調(diào)GES-1細胞內(nèi)Bax蛋白的表達。
　　 1.3.2.2.2.3不同濃度ST作用8天對GES-1細胞NF-κB表達的影響
　　 Western Blot結(jié)果顯示，ST作用8天后，0.

38、3μM、1.5μM和3μM ST處理組細胞的NF-κB蛋白表達水平較溶劑對照組明顯下降(P＜0.05)，且其表達量隨著ST濃度的增加而減少(r=-0.803，P＜0.01)。提示ST處理8天可以劑量依賴性地下調(diào)GES-1細胞內(nèi)NF-κB蛋白的表達。
　　 1.3.2.2.2.4不同濃度ST作用8天對Caspase-3蛋白表達的影響
　　 Western Blot結(jié)果顯示，ST處理8天后，0.075～3μM各ST處理組Ca

39、spase-3活性片段的表達均較溶劑對照組明顯增加（P＜0.01），且隨著ST濃度的增加，陽性酶切片段的表達量逐漸升高(r=0.850，P＜0.01)。表明ST處理8天可以激活GES-1細胞Caspase-3，且其活性片段表達水平以劑量依賴方式增加。
　　 第二部分雜色曲霉素對GES-1細胞DNA的損傷作用及損傷通路的激活
　　 目的：探討雜色曲霉素對人胃黏膜上皮細胞(GES-1)DNA的損傷作用及其下游損傷通路的激活情

40、況，揭示ST誘導(dǎo)GES-1細胞G2期阻滯的可能原因。
　　 方法：采用單細胞凝膠電泳試驗觀察ST作用不同時間(2、4、8及12d)對GES-1細胞DNA的損傷情況；采用FCM和Western Blot方法檢測ATM/ATR特異性阻斷劑-caffeine預(yù)處理對ST誘導(dǎo)的G2期阻滯及相關(guān)調(diào)控因子的影響。
　　 結(jié)果：
　　 2.1 ST對GES-1細胞DNA損傷的影響
　　 單細胞凝膠電泳試驗結(jié)果顯示，3μ

41、M ST作用于GES-1細胞可引起DNA的損傷。各不同時間ST處理組與相應(yīng)溶劑對照組相比，DAN損傷指數(shù)(DI)顯著增高(P＜0.001)，且隨著ST作用時間的延長DI逐漸升高，兩者呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.903，p＜0.001)。
　　 不同時間ST處理的GES-1細胞在電泳之后經(jīng)軟件分析出的彗星尾部DNA含量、尾長及尾距三個指標與相應(yīng)的溶劑對照組相比均有顯著地增加，并且存在明顯的時效關(guān)系（P＜0.01）。
　　 以上結(jié)

42、果提示，ST可以引起GES-1細胞DNA損傷，且隨ST作用時間的延長DNA損傷程度相應(yīng)加重，它可能參與了ST誘導(dǎo)的細胞G2期阻滯。
　　 2.2 Caffeine預(yù)處理對ST誘導(dǎo)的GES-1細胞G2期阻滯及細胞周期相關(guān)蛋白的影響
　　 2.2.1 Caffeine預(yù)處理對ST誘導(dǎo)的GES-1細胞G2期阻滯的影響
　　 FCM檢測結(jié)果顯示，caffeine預(yù)處理+ST3μM處理組與ST單獨處理組相比，G2/M期細胞

43、比例明顯減少(P＜0.05)。表明caffeine預(yù)處理可以阻斷ST誘導(dǎo)的細胞G2/M期比例增高，提示ATM/ATR信號通路的激活可能參與了ST誘導(dǎo)的GES-1細胞G2期阻滯。
　　 2.2.2 Caffeine預(yù)處理對ST作用后GES-1細胞G2期關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子表達變化的影響
　　 2.2.2.1 Caffeine預(yù)處理對Cdc25C表達的影響
　　 Western Blot結(jié)果顯示，5mM caffeine預(yù)處

44、理+ST(1.5μM，3μM)處理組Cdc25C的表達水平與ST(1.5μM，3μM)單獨處理組相比明顯提高（P＜0.05）；而Cdc25C的磷酸化水平在caffeine預(yù)處理后較ST單獨處理組有所降低(P＜0.05)。提示ATM/ATR信號通路可能參與了ST誘導(dǎo)的Cdc25C表達降低和p-Cdc25C表達的升高。
　　 2.2.2.2 Caffeine預(yù)處理對Cdc2表達的影響
　　 Western Blot結(jié)果顯示，

45、5mM caffeine預(yù)處理+ST(1.5μM，3μM)處理組Cdc2的表達水平與ST(1.5μM，3μM)單獨處理組相比明顯升高(P＜0.05）；而Cdc2的磷酸化水平在caffeine預(yù)處理后則有所降低(P＜0.05)。提示ATM/ATR信號通路可能參與了ST誘導(dǎo)的Cdc2表達的降低和p-Cdc2表達的升高。
　　 2.2.2.3 Caffeine預(yù)處理對CyclinB1表達的影響
　　 Western Blot結(jié)

46、果顯示，5mM caffeine預(yù)處理+ST(1.5μM，3μM)處理組CyclinB1的表達水平與ST單獨處理組相比無明顯變化(P＞0.05）。
　　 2.3 Caffeine預(yù)處理對p-p53表達的影響
　　 Western Blot結(jié)果顯示，與溶劑對照組相比，5mM caffeine預(yù)處理組p-p53的表達水平顯著降低；1.5μM ST和3μM ST單獨處理組p-p53的表達水平均明顯升高(P＞0.05)；5mM

47、caffeine預(yù)處理+ST(1.5μM，3μM)處理組p-p53的表達水平與ST（1.5μM，3μM）單獨處理組相比明顯降低(P＞0.05)。提示，ST作用2天激活了p53;p53是ATM/ATR信號通路中的的一員；ATM/ATR信號通路可能參與了ST誘導(dǎo)的p-p53表達的升高。
　　 第三部分、雜色曲霉素誘導(dǎo)GES-1細胞周期G2期阻滯及凋亡的可能分子機制
　　 目的：探討雜色曲霉素誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人胃黏膜上皮細胞(G

48、ES-1)G2期阻滯及凋亡的可能分子機制。
　　 方法：采用Western Blot和real-time PCR技術(shù)觀察ST對p53-p21WAF1/CIP1信號通路相關(guān)分子表達的影響。進一步通過p53 siRNA轉(zhuǎn)染干擾p53基因表達，Western Blot方法檢測p53-p21WAF1/CIP1信號通路相關(guān)分子及細胞G2/M期調(diào)控因子的表達變化情況，F(xiàn)CM方法檢測細胞周期的變化情況。
　　 結(jié)果：
　　 3

49、.1 ST對GES-1細胞p53-p21WAF1/CIP1信號通路的影響
　　 3.1.1 ST作用不同時間對p53-p21WAF1/CIP1信號通路的的影響
　　 3.1.1.1 ST作用不同時間對p53蛋白的影響
　　 Western Blot結(jié)果顯示，3μM ST處理GES-1細胞2、4、8及12天后，各ST處理組p-p53(Ser15)和p53蛋白水平均較對照組明顯升高（P＜0.05）；在ST處理8天時p

50、-p53(Ser15)的表達量達最大值，12天又明顯下降(P＜0.05)。提示ST處理GES-1細胞可以時間依賴性地激活p53，并且p-p53在第8天出現(xiàn)峰值后12天又下降。
　　 Real time-PCR檢測結(jié)果顯示，ST2、4、8及12d處理組的p53mRNA水平均較對照組明顯升高(P＜0.01)，且ST作用8天時達峰值，12天時又下降（P＜0.05）。提示，ST作用于GES-1細胞可以上調(diào)p53 mRNA的表達，且第8天

51、出現(xiàn)峰值，之后下降。與p53在蛋白水平上的激活時間保持一致。
　　 以上p53的激活在時間上與G2期阻滯和凋亡基本一致。
　　 3.1.1.2 ST作用不同時間對p21WAF1/CIP1蛋白的影響
　　 Western Blot結(jié)果顯示，3μM ST處理GES-1細胞2、4、8及12天后，各ST處理組p21WAF1/CIP1蛋白水平均較對照組明顯升高(P＜0.05）；在ST處理后8天時其表達量達最大值，12天又有

52、所下降(P＜0.05）。提示ST作用于GES-1細胞可以時間依賴性地激活p21WAF1/CIP1，并且其在第8天出現(xiàn)峰值后12天又下降。p21WAF1/CIP1的激活在時間上在時間上與G2期阻滯和凋亡基本一致。
　　 3.1.2不同濃度ST對p53-p21WAF1/CIP1信號通路的的影響
　　 3.1.2.1不同濃度ST作用4天對p53-p21WAF1/CIP1信號通路的的影響
　　 3.1.2.1.1不同濃度

53、ST作用4天對p53蛋白的影響
　　 Western Blot結(jié)果顯示，0.075μM、0.3μM、1.5μM及3μ.M ST處理GES-1細胞4d后，各ST處理組p-p53(Ser15)蛋白水平均較溶劑對照組明顯升高（P＜0.05）；除0.075μM ST處理組外，各ST處理組p53蛋白水平較溶劑對照組明顯升高(P＜0.05）。并且p53的去磷酸化和磷酸化水平均隨ST濃度的增加而升高(r=0.893;r=0.866，P＜0.0

54、1)。提示ST作用于GES-1細胞4天可以劑量依賴性地激活p53。
　　 Real time-PCR檢測結(jié)果顯示，除0.075μM ST處理組外，其它各ST處理組的p53 mRNA水平均較溶劑對照組明顯升高(P＜0.01)。提示，不同濃度ST作用于GES-1細胞4天可以上調(diào)p53 mRNA的表達。
　　 3.1.2.1.2不同濃度ST作用4天對p21WAF1/CIP1蛋白的影響
　　 Western Blot結(jié)果

55、顯示，0.075μM、0.3μM、1.5μM及3μM ST處理GES-1細胞4d后，各ST處理組p21蛋白表達水平均較溶劑對照組明顯升高(P＜0.05），且隨ST濃度的增加而升高(r=0.910，P＜0.01)。提示ST作用于GES-1細胞4天可以劑量依賴性地激活p21WAF1/CIP1。
　　 3.1.2.2不同濃度ST作用8天對p53-p21WAF1/CIP1信號通路的影響
　　 3.1.2.2.1不同濃度ST作用8

56、天對p53蛋白的影響
　　 Western Blot結(jié)果顯示，0.075μM、0.3μM、1.5μM及3μM ST處理GES-1細胞8d后，各ST處理組p-p53(Ser15)蛋白水平均較溶劑對照組明顯升高(P＜0.05）；除0.075μM ST處理組外，各ST處理組p53蛋白水平較溶劑對照組明顯升高（P＜0.05）。并且p53的去磷酸化和磷酸化水平均隨ST濃度的增加而升高(r=0.836;r=0.879，P＜0.01)。提示S

57、T作用于GES-1細胞8天可以劑量依賴性地激活p53。
　　 3.1.2.2.2不同濃度ST作用8天對p21WAF1/CIP1蛋白的影響
　　 Western Blot結(jié)果顯示，0.075μM、0.3μM、1.5μM及3μM ST處理GES-1細胞8d后，各ST處理組p21蛋白表達水平均較溶劑對照組明顯升高（P＜0.05），且隨ST濃度的增加而升高(r=0.926，P＜0.01)。提示ST作用于GES-1細胞8天可以劑量

58、依賴性地激活p21WAF1/CIP1。
　　 3.2 p53 siRNA轉(zhuǎn)染對ST作用后GES-1細胞的影響
　　 3.2.1 p53 siRNA轉(zhuǎn)染對ST作用后GES-1細胞p53-p21WAF1/CIP1信號通路的影響
　　 3.2.1.1 p53 siRNA轉(zhuǎn)染對ST作用后GES-1細胞p53蛋白的影響
　　 Real time PCR結(jié)果顯示，p53 siRNA單獨轉(zhuǎn)染組細胞在p53的mRNA水平

59、較溶劑對照組顯著降低(P＜0.01，論文中未列出)；Western Blot結(jié)果顯示，p53 siRNA單獨轉(zhuǎn)染組細胞p53的磷酸化和非磷酸化蛋白表達水平均較溶劑對照組顯著降低(P＜0.01)。并且p53在mRNA和蛋白水平的有效抑制率均達到70％～80％，證明p53siRNA的轉(zhuǎn)染成功地干擾了p53的表達。
　　 Western Blot結(jié)果顯示，p53 siRNA+ST(3μM)處理組p-p53(Ser15)及p53的蛋白表

60、達水平與ST(3μM)處理組相比均明顯降低(P＜0.05）；而與p53 siRNA處理組相比均顯著升高(P＜0.05）。提示，p53 siRNA的轉(zhuǎn)染可以阻斷ST誘導(dǎo)的GES-1細胞p53的激活。
　　 3.2.1.2 p53 siRNA轉(zhuǎn)染對ST作用后GES-1細胞p21WAF1/CIP1蛋白的影響
　　 Western Blot結(jié)果顯示，p53 siRNA+ST(3μM)處理組p21WAF1/CIP1的蛋白表達水平與

61、ST(3μM)處理組相比明顯降低（P＜0.05）；而與p53 siRNA處理組相比均顯著升高（P＜0.05）。提示，p53 siRNA的轉(zhuǎn)染可以阻斷ST誘導(dǎo)的GES-1細胞p21WAF1/CIP1的激活。
　　 3.2.2 p53 siRNA轉(zhuǎn)染對ST作用后GES-1細胞G2期關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子表達變化的影響
　　 3.2.2.1 p53 siRNA轉(zhuǎn)染對ST作用后GES-1細胞Cdc25C的影響
　　 Western

62、 Blot結(jié)果顯示，p53 siRNA+ST(3μM)處理組與ST(3μM)處理組相比，Cdc25C的蛋白表達水平明顯升高，而p-Cdc25C的水平則顯著下降（P＜0.05）。而p53 siRNA+ST(3μM)處理組p-Cdc25C的蛋白表達水平與p53 siRNA處理組相比有顯著升高（P＜0.05）。提示，p53參與了ST誘導(dǎo)的GES-1細胞Cdc25C表達的下調(diào)和p-Cdc25C表達的上調(diào)。
　　 3.2.2.2 p53

63、siRNA轉(zhuǎn)染對ST作用后GES-1細胞Cdc2的影響
　　 Western Blot結(jié)果顯示，p53 siRNA+ST(3μM)處理組與ST(3μM)處理組相比，Cdc2表達增多，而p-Cdc2表達則顯著減少(P＜0.05); p53 siRNA+ST(3μM)處理組與p53 siRNA處理組相比，Cdc2表達水平有所降低，而p-Cdc2的表達水平則有顯著升高（P＜0.05）。提示，p53參與了ST誘導(dǎo)的GES-1細胞Cdc2

64、表達的下調(diào)和p-Cdc2表達的上調(diào)。
　　 3.2.2.3 p53 siRNA轉(zhuǎn)染對ST作用后GES-1細胞CyclinB1的影響
　　 Western Blot結(jié)果顯示，p53 siRNA+ST(3μM)處理組CyclinB1的蛋白表達水平與ST(3μM)處理組相比有顯著下降，而與p53 siRNA處理組相比則有顯著升高(P＜0.05)。提示，p53參與了ST誘導(dǎo)的GES-1細胞CyclinB1蛋白表達的上調(diào)。

65、　　 3.2.3 p53 siRNA轉(zhuǎn)染對ST作用后GES-1細胞凋亡相關(guān)蛋白表達變化的影響
　　 3.2.3.1 p53 siRNA轉(zhuǎn)染對ST作用后GES-1細胞Bcl-2的影響
　　 Western Blot結(jié)果顯示，ST(3μM)處理組與溶劑對照組相比，Bcl-2的蛋白表達水平顯著下降（P＜0.05）；而p53 siRNA+ST(3μM)處理組與ST(3μM)處理組相比Bcl-2水平無明顯變化（P＞0.05）。提

66、示，p53 siRNA轉(zhuǎn)染不足以逆轉(zhuǎn)ST對GES-1細胞Bcl-2表達的下調(diào)作用。
　　 3.2.3.2 p53 siRNA轉(zhuǎn)染對ST作用后GES-1細胞Bax的影響
　　 Western Blot結(jié)果顯示，p53 siRNA+ST(3μM)處理組Bax的蛋白表達水平與ST(3μM)處理組相比有顯著下降，而與p53 siRNA處理組相比則有明顯升高（P＜0.05）。提示，p53參與了ST誘導(dǎo)的GES-1細胞Bax蛋白表達

67、的上調(diào)。
　　 3.2.3.3 p53 siRNA轉(zhuǎn)染對ST作用后GES-1細胞Caspase-3的影響
　　 Western Blot結(jié)果顯示，p53 siRNA+ST(3μM)處理組在17kD處的Caspase-3活性酶切片段與ST(3μM)處理組相比明顯減少，而與p53 siRNA處理組相比則有明顯增加(P＜0.05)。提示，p53參與了ST誘導(dǎo)的GES-1細胞caspase-3的激活。
　　 3.2.4

68、p53 siRNA轉(zhuǎn)染對ST誘導(dǎo)的GES-1細胞G2期阻滯的影響
　　 FCM檢測結(jié)果顯示，與ST(3μM)處理組相比，p53 siRNA+ST(3μM)處理組G2/M期細胞比例明顯降低（P＜0.05）。表明p53 siRNA轉(zhuǎn)染可以阻斷ST誘導(dǎo)的細胞G2/M期比例增高，提示p53以及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活可能參與了ST誘導(dǎo)的細胞周期G2期阻滯。
　　 結(jié)論：
　　 1.ST可以抑制GES-1細胞增殖及誘導(dǎo)其發(fā)

69、生G2期阻滯和凋亡，而ST可能正是通過誘導(dǎo)G2期阻滯和凋亡來抑制GES-1細胞增殖的。
　　 2.ST通過抑制Bcl-2和促進Bax蛋白表達來激活線粒體凋亡途徑，隨后激活caspase-3而最終誘導(dǎo)GES-1細胞發(fā)生凋亡。
　　 3.ST可以引起GES-1細胞DNA的損傷并激活損傷下游ATM/ATR信號通路。ATM/ATR特異性阻斷劑可以阻斷ST誘導(dǎo)的G2期阻滯。由此可見，ATM/ATR信號通路的激活可能參與了ST誘導(dǎo)的

70、GES-1細胞G2期阻滯，且在這一過程中ST引起的DNA損傷是一個起始事件。
　　 4.ST可以激活p53-p21WAF1/CIP1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，并且通過siRNA干擾p53基因的表達證實了p53-p21WAF1/CIP1信號通路的激活參與了ST誘導(dǎo)的GES-1細胞G2期阻滯和凋亡。
　　 5.從ST的時間效應(yīng)來看，ST引起的GES-1細胞凋亡的發(fā)生晚于其誘導(dǎo)的G2期阻滯，它們的效應(yīng)高峰分別出現(xiàn)在ST作用后8天和4天。并