雜色曲霉素、乙醇聯(lián)合染毒致人肝細胞Hep G2 DNA鏈斷裂機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:研究發(fā)現(xiàn)雜色曲霉素(Sterigmatocystin,ST)作為繼黃曲霉毒素之后的第二大真菌毒素,廣泛存在于自然界中,可污染多種糧食作物,在ST污染嚴重的地區(qū),居民患有胃癌和肝癌的機率高于其他地區(qū)。而乙醇的攝入在近些年來也逐漸增加,長期大量的飲酒可誘發(fā)多種疾病,尤其是肝損害。在日常生活中,人們可能同時攝入兩種物質,我們猜想是否有毒物質的聯(lián)合攝入比單一攝入對身體健康傷害更大。因此,本實驗以體外實驗為研究手段,探究乙醇和ST的聯(lián)合處理

2、是否可增加這2種毒物肝損傷程度;并從氧化應激和溶酶體膜穩(wěn)定性兩個方面來探討其DNA損傷的機制。
   方法:實驗體系選定人肝細胞HepG2,實驗步驟如下:1.采用MTT細胞存活率實驗,確定染毒劑量;金正均法計算合并效應相關系數(shù),確定兩者相互作用關系。2.采用單細胞凝膠電泳(SCGE)實驗檢測HepG2細胞DNA的損傷狀況;用Hoechst33258染色檢驗細胞凋亡。3.采用2',7'二氫二氯熒光素(DCFH)染色法檢測HepG2

3、細胞中ROS的水平。4.熒光色素吖啶橙(Acridineorange,AO)染色法測定HepG2細胞內溶酶體膜的穩(wěn)定性。5.應用SPSSv11.5統(tǒng)計軟件包對實驗結果進行統(tǒng)計分析。
   結果:1.MTT實驗結果顯示ST的IC50為10.1μg/mL,乙醇的IC50為1190.4μg/mL。乙醇240μg/mL和ST1μg/mL聯(lián)合作用處理HepG2細胞24h后,聯(lián)合系數(shù)為q=0.99,呈單純相加作用。2.HepG2細胞在ST0

4、.5、1和2μg/mL分別處理0.5、1和2h,乙醇60、120和240μg/mL分別處理1h后引起DNA斷裂,細胞出現(xiàn)彗星樣的拖尾,尾長的增長同對照組相比呈劑量依賴關系,并具有統(tǒng)計學意義。聯(lián)合處理0.5h后HepG2細胞開始出現(xiàn)DNA損傷。ST和乙醇聯(lián)合作用2h處理后,細胞損傷程度加劇且細胞凋亡的數(shù)量大于10%。3.ST、乙醇單獨處理HepG2細胞0.5h后可引起ROS生成量增加,聯(lián)合處理組ROS的生成量與單獨乙醇處理組相比增加。4.

5、HepG2細胞在ST單獨處理1h或乙醇處理0.5h后,溶酶體膜穩(wěn)定性開始發(fā)生變化。在不同劑量乙醇中聯(lián)合使用1μg/mLST染毒1h,可測得的細胞AO熒光強度達到頂峰,2h聯(lián)合染毒處理組時發(fā)生回落,總體較乙醇單獨染毒處理組有顯著性差異。
   結論:與乙醇單獨作用相比,雜色曲霉素和乙醇的混合處理會降低細胞存活率,增加HepG2細胞DNA鏈斷裂程度,加劇DNA損傷。其作用機制可能是乙醇和ST聯(lián)合作用均可造成細胞損傷且其損傷一部分原因

6、與溶酶體途徑以及氧化應激途徑有關。ST和乙醇聯(lián)合處理可引起細胞內ROS的和AO熒光值強度的增加,且增加量與時間和劑量有一定的依賴關系。聯(lián)合染毒處理2h后,細胞損傷繼續(xù)加劇,與乙醇單獨處理組相比,ROS生成量和AO熒光強度沒有顯著增加,AO熒光強度反而比乙醇單獨作用減少,可能與凋亡細胞增多有關,這在彗星實驗中也得到驗證。因此ST和乙醇聯(lián)合處理HepG2細胞誘發(fā)DNA損傷加劇的原因可能一部分來自于氧化應激作用,一部分來自與溶酶體破裂對細胞D

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