hsa-miR-626對(duì)Hep G2細(xì)胞中載脂蛋白(a)表達(dá)的影響.pdf

1、目的：脂蛋白（a）[lipoprotein(a),Lp(a)]由載脂蛋白（a）[apolipoprotein(a),apo(a)]和載脂蛋白B-100（apolipoprotein B-100,apoB100）通過(guò)二硫鍵連接而成，主要在肝細(xì)胞中合成。許多臨床研究表明高 Lp(a)血漿水平是動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,As)相關(guān)疾病如早發(fā)性心血管疾病中風(fēng)等的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。Lp(a)血漿水平對(duì)許多藥物和非藥物的治療方法不敏

2、感，血液透析是唯一能將 Lp(a)水平降低50％以上的方法。在機(jī)體內(nèi)調(diào)節(jié)apo(a)表達(dá)機(jī)制方面，除發(fā)現(xiàn)apo(a)基因LPA的一些單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP)能影響Lp(a)血漿水平外，未見(jiàn)其它報(bào)道。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個(gè)miRNAs和動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis, As）以及脂質(zhì)代謝相關(guān)，本研究擬通過(guò)生物信息學(xué)的方法篩選調(diào)控LPA基因的microRNA，然后在肝細(xì)胞

3、中驗(yàn)證其降apo(a)效用。
　　方法：通過(guò)生物信息學(xué)分析LPA3’端非翻譯區(qū)（3’- Untranslated Regions,3’-UTR）序列中的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并通過(guò)在線預(yù)測(cè)工具預(yù)測(cè)可能作用于 LPA基因的miRNAs。用western blot篩選apo(a)高表達(dá)細(xì)胞株；通過(guò)熒光檢測(cè)miRNA mimics轉(zhuǎn)染效率。分別通過(guò)RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照miRNA mimic和轉(zhuǎn)染預(yù)測(cè)所得miRNA mimics處理組6h、1

4、2h和24h Hep G2 LPA mRNA表達(dá)水平；通過(guò)western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照miRNA mimic和轉(zhuǎn)染預(yù)測(cè)所得miRNA mimics處理組24h、36h和48h Hep G2 apo(a)表達(dá)水平。通過(guò)western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照miRNA、miR-626mimic、miR-626 mimic+miR-626 inhibitor和miR-626 inhibitor處理48h Hep G2 apo(a

5、)表達(dá)水平。使用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)行miR-626靶標(biāo)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(± SD)表示，用Graphpad Prism5.0.1對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和作圖，選取95%可信區(qū)間，P<0.05為差異有顯著性意義。
　　結(jié)果：生物信息學(xué)預(yù)測(cè)可能作用于LPA的miRNAs為miR-655、miR-590-3p、miR-519a、miR-519b-3p、miR-338-3p、miR-519c-3p、miR-590

6、-5p、miR-425、miR-626。 Hep G2細(xì)胞 apo(a)表達(dá)水平較高，可用來(lái)做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。miR-655、miR-590-3p、miR-519a、miR-519b-3p、miR-338-3p、miR-519c-3p、miR-590-5p、miR-425和miR-626 mimics處理組與對(duì)照組相比LPA mRNA表達(dá)水平均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；miR-655 mimic和miR-590-5p mimic能輕微下調(diào)Hep G2

7、表達(dá)apo(a)，而 miR-626 mimic能顯著下調(diào) Hep G2表達(dá) apo(a)。miR-626 mimic+miR-626 inhibitor處理組 apo(a)表達(dá)水平顯著高于 miR-626 mimic處理組，miR-626 inhibitor處理組apo(a)表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。轉(zhuǎn)染miR-626處理組細(xì)胞裂解后熒光強(qiáng)度顯著低于對(duì)照組。
　　結(jié)論：miR-626顯著下調(diào)apo(a)表達(dá)水平；miR-626下調(diào)