離體肝細(xì)胞Hsa-miR-660基因表達(dá)調(diào)控對(duì)CYP3A4蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、背景及目的：
　　芬太尼為阿片類鎮(zhèn)痛藥物，鎮(zhèn)痛作用好，是嗎啡鎮(zhèn)痛作用的50-100倍，廣泛應(yīng)用于臨床麻醉以及癌癥病人的鎮(zhèn)痛治療中。臨床工作中發(fā)現(xiàn)，不同患者使用同等劑量的芬太尼產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛效果和副作用明顯不同。芬太尼主要通過(guò)肝臟中CYP3A4酶進(jìn)行代謝成為幾乎沒(méi)有活性的去甲基芬太尼，研究發(fā)現(xiàn)，不同患者的CYP3A4酶活性差異性很大，而基因多態(tài)性是影響CYP3A4酶活性的主要因素。
　　近年來(lái)，人們研究發(fā)現(xiàn)一種小分子單鏈RNA（m

2、iRNA）可以作用于基因的轉(zhuǎn)錄后過(guò)程，影響蛋白的表達(dá)，在生命的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。肝臟組織中也發(fā)現(xiàn)了多種miRNA,但是這些miRNA有些是無(wú)功能的，有些是有功能的，需要進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。有研究指出Hsa-miR-660可能與CYP3A4酶活性存在相關(guān)性，但尚且沒(méi)有進(jìn)行細(xì)胞水平的驗(yàn)證。
　　本實(shí)驗(yàn)主要研究肝細(xì)胞中Hsa-miR-660相對(duì)表達(dá)量對(duì)CYP3A4蛋白表達(dá)的影響。
　　材料與方法：
　　所用的細(xì)

3、胞為人正常肝細(xì)胞chang liver，將穩(wěn)定表達(dá)的chang liver細(xì)胞培養(yǎng)于37°5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清RPMI1640，2-3天換一次培養(yǎng)基，保證細(xì)胞可以正常生長(zhǎng)。在細(xì)胞生長(zhǎng)良好時(shí)可準(zhǔn)備病毒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞鋪于6孔板上，繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，在細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時(shí)可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分為四組：分別為對(duì)照組（C）、miRNA過(guò)表達(dá)組（H）、miRNA沉默組(L)和陰性載體組（N)。C組加入等量的完全培養(yǎng)基

4、，L組加入包裹抑制Hsa-miR-660表達(dá)質(zhì)粒的慢病毒，H組加入包裹過(guò)表達(dá)Hsa-miR-660質(zhì)粒的慢病毒，N組加入包裹空載體的慢病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)按MOI=50加入病毒后共同培養(yǎng)，24小時(shí)后將含有病毒的培養(yǎng)基吸出，加入含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48-72h后進(jìn)行在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功后一部分細(xì)胞提取總RNA，實(shí)時(shí)熒光定量法進(jìn)行測(cè)定CYP3A4 mRNA相對(duì)表達(dá)量和Hsa-miR-660相對(duì)表達(dá)量。內(nèi)參

5、分別為GAPDH和U6。剩余細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)較為旺盛時(shí)提取總蛋白，western blot法測(cè)定CYP3A4的相對(duì)表達(dá)量，內(nèi)參為GAPDH。
　　結(jié)果：
　　1.轉(zhuǎn)染效率測(cè)定
　　熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，H組、L組、N組三組轉(zhuǎn)染效率均為50%-70%。
　　2.Hsa-miR-660相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定四組Hsa-miR-660相對(duì)表達(dá)量，F(xiàn)=31.857，P〈0.05，

6、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.N組與 C組相比,差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.564〉0.05）.H組較C組Hsa-miR-660表達(dá)量顯著增加，L組較C組Hsa-miR-660表達(dá)量顯著降低。H組（8.372±0.403）較N組（4.847±0.511）Hsa-miR-660表達(dá)量顯著增加，L組（2.985±0.407）較N組（4.847±0.511）Hsa-miR-660表達(dá)量顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.CYP3A4 mRNA表

7、達(dá)量的測(cè)定
　　RT-PCR法測(cè)定四組CYP3A4 mRNA，四組mRNA的表達(dá)量不存在差異， F=0.381，P=0.768>0.05。
　　4.CYP3A4蛋白表達(dá)量的測(cè)定
　　western blot法測(cè)定四組CYP3A4蛋白相對(duì)表達(dá)量，四組之間CYP3A4蛋白的相對(duì)表達(dá)量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，F(xiàn)=20.225，P〈0.01。C組和N組之間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〉0.05）, H組較C組CYP3A4蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降

8、低，L組較C組CYP3A4蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高;H組（0.00548±0.00186）較N組（0.01768±0.04633）CYP3A4蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低， L組（0.04092±0.01112）較 N組（0.01768±0.04633）CYP3A4蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高,差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P〈0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.Hsa-miR-660并不影響CYP3A4 mRNA的穩(wěn)定性。
　　2.細(xì)胞水