重組人CYP3A4大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的建立.pdf

1、細(xì)胞色素酶P450(CYP)是含有血紅素的一族單加氧酶，主要參與代謝內(nèi)源物質(zhì)（如甾體、膽汁酸、脂肪酸、前列腺素、花生四烯酸、生物源性氨類(lèi)等）和外源性物質(zhì)的代謝。細(xì)胞色素酶能夠催化生物界各種外源物質(zhì)的氧化代謝，包括藥物、植物提取成分或被真菌衍生的食物的次級(jí)代謝產(chǎn)物及大量的環(huán)境污染物、工業(yè)化合物、除草劑和除蟲(chóng)劑等。代謝外源物質(zhì)的人源細(xì)胞色素酶P450的形式有CYP1，CYP2和CYP3家族。這些家族中的個(gè)別細(xì)胞色素酶P450具有很廣泛的和重

2、疊的底物特異性，負(fù)責(zé)約70-80％目前臨床使用藥物的代謝。
　　 人類(lèi)細(xì)胞色素酶P450在代謝內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)包括藥物中起重要的作用，因此，新的候選藥在臨床前開(kāi)放階段測(cè)試其與細(xì)胞色素酶間的相互作用是標(biāo)準(zhǔn)程序。
　　 藥物和其他外源物質(zhì)通過(guò)誘導(dǎo)或抑制對(duì)細(xì)胞色素酶活性調(diào)節(jié)，是藥物相互作用的基礎(chǔ)。藥物的相互作用可以引起嚴(yán)重不良反應(yīng)，這將導(dǎo)致藥物開(kāi)發(fā)的提前終止，拒絕批準(zhǔn)上市，嚴(yán)重的處方限制，甚至于從市場(chǎng)上撤回藥品。最常見(jiàn)的

3、藥物相互作用機(jī)制是對(duì)細(xì)胞色素酶的抑制。
　　 在藥物開(kāi)發(fā)前期，要常規(guī)開(kāi)展實(shí)驗(yàn)來(lái)確定前體物質(zhì)是由哪些細(xì)胞色素酶代謝的。此外，前體物質(zhì)對(duì)細(xì)胞色素酶的抑制作用可用體外培養(yǎng)的方法來(lái)評(píng)估。通常，但并非總是，一種化合物能夠抑制特定的細(xì)胞色素酶P450類(lèi)型，同時(shí)也是這種細(xì)胞色素酶P450的底物。
　　 CYP3A4是人體內(nèi)重要的細(xì)胞色素酶P450之一，占CYPs總量50％。CYP3A4在外源性物質(zhì)代謝中具有舉足輕重的作用，據(jù)估計(jì)有高達(dá)

4、50％以上的臨床使用的藥物由CYP3A4代謝。CYP3A4能被多種藥物誘導(dǎo)和抑制，且具有基因多態(tài)性，這是造成藥物作用個(gè)體差異的最重要因素之一，也是發(fā)生藥物相互作用的原因之一。CYP3A4的活性部位非常強(qiáng)大和其作用具有彈性，能允許結(jié)構(gòu)非常不同的化合物結(jié)合與隨后的代謝。
　　 大腸桿菌是用于表達(dá)人類(lèi)細(xì)胞色素酶P450最常用的宿主。除了具有簡(jiǎn)單的遺傳操作和培養(yǎng)外，大腸桿菌因其本身沒(méi)有自己的細(xì)胞色素酶，成為表達(dá)人類(lèi)細(xì)胞色素酶P450的合

5、適宿主。同時(shí)，在大腸桿菌中蛋白的產(chǎn)量是非常高的，因此重組細(xì)胞色素酶P450在大腸桿菌中的表達(dá)水平是在釀酒酵母菌種表達(dá)水平的50-100倍。一般來(lái)說(shuō)，人類(lèi)細(xì)胞色素酶P450在大腸桿菌中表達(dá)的表達(dá)水平，可以從文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)，在一個(gè)顯著的范圍內(nèi)變化。表達(dá)水平的不同可以歸因于不同表達(dá)宿主的使用和遺傳策略的實(shí)施。在大腸桿菌中表達(dá)人類(lèi)細(xì)胞色素酶P450的表達(dá)水平關(guān)鍵取決于在培養(yǎng)這些大腸桿菌菌株時(shí)的培養(yǎng)條件。
　　 1991年，哺乳動(dòng)物細(xì)胞色素酶

6、P450蛋白通過(guò)對(duì)N-末端氨基酸序列的修飾第一次表達(dá)在大腸桿菌細(xì)胞中。自此后，為了使重組細(xì)胞色素酶P450在大腸桿菌中由功能的表達(dá)，各種不同的策略已經(jīng)建立，包括N-末端序列的修飾，分子伴侶的使用和在低溫度下培養(yǎng)。在所以情況下，在大腸桿菌中表達(dá)的人類(lèi)細(xì)胞色素酶P450已被證明具有高效地催化氧化代表底物的能力。這些重組的細(xì)胞色素酶P450能夠應(yīng)用于研究，如估計(jì)藥物的氧化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，也能用于鑒定人類(lèi)細(xì)胞色素酶P450對(duì)藥物的代謝途徑和致癌

7、物質(zhì)的消除機(jī)制?，F(xiàn)在可以使用各種不同種類(lèi)的重組人類(lèi)細(xì)胞色素酶用于各種目的，在制備一個(gè)新的候選藥物的過(guò)程中，確定其代謝酶類(lèi)已經(jīng)成為了例行常規(guī)。這種方法已被用于體外制定合理的策略來(lái)預(yù)測(cè)相關(guān)的生物利用度，毒性和藥物間相互作用。
　　 目的:
　　 比較生理鹽水和RNAlater溶液兩種處理保存組織方法對(duì)提取的總RNA的影響，以得到肝臟組織的比較好的保存方法。
　　 探討α-ALA（0.5mM和1mM）、IPTG（0.5

8、mM和1mM）、卡那霉素（50μg/mL和100μg/mL）添加濃度及菌的接種密度對(duì)重組CYP3A4膜蛋白表達(dá)水平的影響，以?xún)?yōu)化重組CYP3A4在大腸桿菌中表達(dá)條件。
　　 用含有T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體pET-28a(+)，構(gòu)建重人類(lèi)CYP3A4大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，以用于體外研究藥物之間的相互作用，也可以用于新藥開(kāi)發(fā)時(shí)確定新藥的代謝特征及與其他藥物間的相互作用。在重組野生型CYP3A4基礎(chǔ)上通過(guò)定點(diǎn)突變獲得變異的CYP3A4，研究C

9、YP3A4各亞型的藥物代謝與野生型CYP3A4的差異來(lái)指導(dǎo)臨床上個(gè)體化用藥。
　　 方法:
　　 (1)人肝臟總RNA提取:收集的肝臟組織分別RNAlater溶液處理后保存-20℃下。按照TRIZOL(R)Reagent試劑說(shuō)明書(shū)提取肝組織總RNA。測(cè)定總RNA的濃度和純度，并用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)驗(yàn)證總RNA的完整性。
　　 (2)CYP3A4基因的克隆、修飾及鑒定:用逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增法(RT-PCR

10、)，以總RNA為模板擴(kuò)增目的基因CYP3A4。用1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，割膠后，用凝膠回收試劑盒回收CYP3A4cDNA。將目的基因連接到pMD(R)20-T載體上，熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coliDH5α中。經(jīng)藍(lán)白斑篩選并菌落PCR驗(yàn)證正確后，對(duì)目的基因進(jìn)行N-末端MALLLAVF修飾和C-末端His(5)加尾修飾。連接到pMD(R)20-T（T載體）上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，菌落PCR驗(yàn)證后，送公司

11、測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果正確的重組T載體（含有CYP3A4基因）經(jīng)NcoI和XhoI雙酶切后連接到經(jīng)過(guò)同樣酶切的pET-28a(+)上，轉(zhuǎn)化都E.coliDH5α中，篩選、驗(yàn)證并提取質(zhì)粒測(cè)序。
　　 (3)根據(jù)TakaraMutanBESTKit(D401)試劑盒定點(diǎn)突變?cè)?，分別設(shè)計(jì)CYP3A4突變比較高的亞型CYP3A4*3、CYP3A4*15、CYP3A4*17、CYP3A4*18和CYP3A4*19的5’端鄰接（含有突變位

12、點(diǎn)），3'端方向相反的引物以導(dǎo)入突變位點(diǎn)。同時(shí)根據(jù)參考文獻(xiàn)上的引物合成上述五種亞型的突變引物。分別用TakaraMutanBESTKit(D401)試劑盒和重疊PCR兩種方法對(duì)CYP3A4進(jìn)行定點(diǎn)突變。突變后PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，割膠，用膠回收試劑盒回收目的片段，分別連接到表達(dá)載體或者自連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，經(jīng)克隆篩選，菌落PCR驗(yàn)證后送公司測(cè)序。
　　 (4)將測(cè)序正確的重組表達(dá)載體pET-3A4轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株E.coliBL

13、21(DE3)中。通過(guò)SPSS13.0設(shè)計(jì)四因素二水平正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)α-ALA(0.5mM和1mM)、IPTG(0.5mM和1mM)、卡那霉素（50μg/mL和100μg/mL）添加濃度及菌的接種密度（接種1％和接種2％）進(jìn)行優(yōu)化。并用SPSS13.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，選擇出比較好的組合進(jìn)行下一步的大規(guī)模的誘導(dǎo)表達(dá)。
　　 誘導(dǎo)結(jié)束后，將菌液置于冰上冰凍10分鐘，離心收集菌體。用TES（Tris-EDTA-sucrose）重懸菌體，

14、并加入含溶菌酶的Tris緩沖液，冰上搖床孵育裂解細(xì)胞。離心后，收集球狀體.沉淀用SRB緩沖液(spheroplasts-resuspendedbuffer)再懸浮，并在-80℃保存。保存的球狀體在室溫下解凍，然后加入1mMPMSF（phenylmethanesulfonylfluoride）和蛋白酶抑制劑。對(duì)懸浮液進(jìn)行超聲處理破碎處理后，離心，取上清液小心的轉(zhuǎn)移到EP管中，再次高倍離心收集膜片段，膜片段用PB重懸，-80℃保存，備用。用

15、BCA蛋白濃度定量分析測(cè)定膜蛋白的濃度。BSA蛋白濃度和OD578做回歸分析。提取的膜蛋白經(jīng)Westernblot驗(yàn)證是否是所需的目的蛋白。
　　 結(jié)果:
　　 (1)總RNA的濃度在300μg/gFW以上，純度在OD260/OD280為1.96±0.015(純凈的RNA的OD260/OD280值為2.0)，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)總RNA的完整性比較，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 (2)目的基因連接到T載體上

16、經(jīng)克隆篩選后，測(cè)序驗(yàn)證為CYP3A4基因。N-末端和C-末端修飾后，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證修飾成功。連接到表載體上，克隆篩選后，測(cè)序驗(yàn)證為CYP3A4基因。
　　 (3)對(duì)CYP3A4進(jìn)行定點(diǎn)突變后，獲得CYP3A4*3，*15，*17，*18，*19亞型，經(jīng)PCR驗(yàn)證正確，當(dāng)測(cè)序結(jié)果顯示僅有CYP3A4*19突變成功。
　　 (4)BSA蛋白濃度和OD578做回歸分析，最終確定線性回歸作為標(biāo)準(zhǔn)曲線(R2=0.999，P＜0.001

17、)。用BCA蛋白濃度定量分析試劑盒測(cè)定的膜蛋白濃度在65μg/mL左右，α-ALA、抗生素（卡那霉素）、T7啟動(dòng)子誘導(dǎo)劑IPTG及接種密度高低兩水平中對(duì)膜蛋白的表達(dá)水平的影響沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別是0.973，0.270，0.346，0.194)。誘導(dǎo)表達(dá)后的膜蛋白經(jīng)Westernblot驗(yàn)證為重組CYP3A4蛋白。
　　 結(jié)論:
　　 成功完成了對(duì)CYP3A4的表達(dá)載體構(gòu)建，并獲得了CYP3A4的一個(gè)亞型CYP3A4