雜色曲霉素暴露對機(jī)體免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的影響及其可能機(jī)制的研究.pdf

1、本研究在前期實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，在整體水平上觀察了ST急性作用對BALB/c小鼠外周血、胸腺、脾臟和皮膚中FoxP3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞和CD123+/BDCA2+漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞的影響，以及小鼠皮膚中CaN和Cc127表達(dá)變化；在細(xì)胞水平上研究了ST急性作用對人外周血單個核細(xì)胞中FoxP3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的影響，同時探討了MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在ST影響FoxP3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞中的作用。
　　 1.雜色曲霉素對BALB/c小

2、鼠外周血及免疫器官中免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的影響研究
　　 目的：探討腹腔注射ST對BALB/c小鼠外周血單個核細(xì)胞及免疫器官中FoxP3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞的影響。
　　 方法：按照3μg/kg、30μg/kg、300μg/kg、3000μg/kg經(jīng)腹腔注射一次性給予雄性BALB/c小鼠ST處理，眼球放血收集小鼠外周靜脈全血，采用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法分離小鼠外周靜脈血單個核細(xì)胞；處死小鼠，胸腺、脾臟組

3、織完整取材。采用FCM檢測小鼠外周血單個核細(xì)胞、胸腺和脾臟內(nèi)CD4+、CD8+和FoxP3+T淋巴細(xì)胞百分率；免疫組化檢測小鼠胸腺和脾臟內(nèi)FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及CD123+/BDCA2+漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞數(shù)量變化情況；蛋白免疫印跡和RT-PCR.方法檢測FoxP3、CD123和BDCA2在蛋白和mRNA水平的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.1 ST對小鼠外周血單個核細(xì)胞中CD4+、CD8+和：FoxP3+T淋巴細(xì)胞的

4、影響:RT-PCR檢測結(jié)果表明，給予ST作用24 h后，與溶劑對照組相比，小鼠外周血單個核細(xì)胞FoxP3 mRNA表達(dá)明顯升高；并且與ST濃度有明顯劑量依賴關(guān)系。
　　 1.2 ST對小鼠胸腺和脾臟內(nèi)FoxP3+T淋巴細(xì)胞的影響:免疫組化結(jié)果顯示，ST30μg/kg、300μg/kg和3000μg/kg劑量組胸腺內(nèi)淋巴細(xì)胞FoxP3+T淋巴細(xì)胞標(biāo)記指數(shù)明顯高于相應(yīng)溶劑對照組；ST各處理組脾臟內(nèi)FoxP3+T淋巴細(xì)胞標(biāo)記指數(shù)也均明

5、顯高于相應(yīng)溶劑對照組。在0～3000μg/kg ST濃度范圍內(nèi)，胸腺和脾臟FoxP3+T淋巴細(xì)胞數(shù)與ST處理濃度有明顯劑量依賴關(guān)系。
　　 1.3 ST對小鼠胸腺和脾臟內(nèi)漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞的影響:免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，30、300和3000μg/kg ST組胸腺細(xì)胞CD123陽性標(biāo)記指數(shù)明顯低于溶劑對照組；而在脾臟細(xì)胞CD123陽性標(biāo)記指數(shù)明顯高于相應(yīng)溶劑對照組；ST中、高劑量處理組胸腺細(xì)胞BDCA2陽性標(biāo)記指數(shù)明顯低于相應(yīng)

6、溶劑對照組；而各ST處理組脾臟細(xì)胞BDCA2陽性標(biāo)記指數(shù)均明顯高于相應(yīng)溶劑對照組；小鼠胸腺和脾臟CD123+和BDCA2+細(xì)胞數(shù)的變化與ST的處理濃度存在明顯劑量依賴關(guān)系。
　　 2.ST對小鼠皮膚組織CaN、Cc127表達(dá)以及FoxP3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞影響的研究
　　 目的：探討一次性腹腔注射給予ST對小鼠皮膚組織CaN和Ge127表達(dá)，以及FoxP3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞浸潤的影響。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)動物模型同

7、前一部分，全層皮膚1×1c㎡取材。取部分皮膚組織4％多聚甲醛固定4 h后，常規(guī)石蠟切片制備，按S-P法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色檢測小鼠皮膚組織CaN+、Cc127+、FoxP3+細(xì)胞數(shù)量變化；取100 mg皮膚組織加入500μL蛋白裂解液，提取皮膚組織總蛋白，Western blot方法檢測CaN、Cc127、FoxP3蛋白的表達(dá)；部分皮膚組織液氮凍存，提取組織RNA，RT-PCR方法檢測CaN、Cc127、FoxP3 mRNA的表達(dá)情況。

8、
　　 結(jié)果：
　　 2.1皮膚組織病理學(xué)變化:病理形態(tài)學(xué)觀察可見各ST處理組動物與溶劑對照組相比，皮膚組織結(jié)構(gòu)均無明顯病理性改變。
　　 2.2 ST對小鼠皮膚組織細(xì)胞CaN和Cc127表達(dá)的影響:免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，30、300和3000μg/kg組CaN陽性標(biāo)記指數(shù)明顯高于溶劑對照組，并且與ST的處理濃度存在劑量依賴關(guān)系；而Cc127陽性標(biāo)記指數(shù)與相應(yīng)溶劑對照組相比，均沒有明顯差別。
　　 2

9、.3 ST對小鼠皮膚內(nèi)FoxP3+T淋巴細(xì)胞的影響:免疫組化染色結(jié)果表明，ST300μg/kg和3000μg/kg處理組FoxP3+T淋巴細(xì)胞標(biāo)記指數(shù)分別為3.30±0.675和4.70±0.949，明顯高于相應(yīng)溶劑對照組，并且在ST0～3000μg/kg濃度范圍內(nèi)，隨著ST處理濃度的升高，F(xiàn)oxP3+T淋巴細(xì)胞標(biāo)記指數(shù)也逐漸增高。
　　 3.雜色曲霉素對體外培養(yǎng)人外周血單個核細(xì)胞中FoxP3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的影響及其可能的機(jī)

10、制研究
　　 目的：探討一次性給予ST處理對人外周血單個核細(xì)胞中FoxP3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的影響及其可能的機(jī)制
　　 方法：采用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法分離人外周靜脈血單個核細(xì)胞（HPBMCs），培養(yǎng)48 h后，用10％1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為（1～2）×108個/L，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。更換2％低血清1640培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別給予ST100μg/L、500μg/L、1000μg/L和2000μg/L處理，溶

11、劑對照組和對照組分別給予DMSO（0.2 mL/L）和生理鹽水處理，繼續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，采用FCM方法檢測HPBMCs中CD4+、CD8+和FoxP3+T淋巴細(xì)胞百分率：采用Western blot方法檢測HPBMCs中FoxP3、JNK、ERK、p38蛋白表達(dá)情況和JNK、ERK和p38的磷酸化水平。
　　 結(jié)果：
　　 3.1 ST對體外培養(yǎng)人外周血單個核細(xì)胞中CD4+、CD8+和FoxP3+T淋巴細(xì)胞影

12、響:FCM檢測結(jié)果顯示，ST處理24 h后，與溶劑對照組相比，不同劑量ST對人外周血單個核細(xì)胞中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞百分率均沒有明顯影響。
　　 3.2體外培養(yǎng)人外周血單個核細(xì)胞FoxP3蛋白表達(dá)的變化情況:Western檢測結(jié)果表明，在0～2000μg/L ST濃度范圍內(nèi)，隨著ST處理濃度的升高，細(xì)胞內(nèi)FoxP3蛋白表達(dá)逐漸升高。
　　 3.3體外培養(yǎng)人外周血單個核細(xì)胞FoxP3 mRNA的變化情況:RT-PC

13、R檢測表明，給予ST作用24 h后，與溶劑對照組相比，體外培養(yǎng)人外周血單個核細(xì)胞FoxP3 mRNA表達(dá)明顯升高；并且與ST濃度有明顯劑量依賴關(guān)系。
　　 3.4 ST對人外周血單個核細(xì)胞中MAPK信號傳導(dǎo)通路的影響
　　 結(jié)果顯示，與溶劑對照組相比，不同濃度ST作用24 h，對人外周血單個核細(xì)胞內(nèi)JNK、ERK和p38 mRNA的表達(dá)也沒有明顯影響。
　　 3.5 MAPK信號傳導(dǎo)通路對ST誘導(dǎo)人外周血單個核細(xì)

14、胞中FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增多的影響
　　 3.5.1 JNK信號傳導(dǎo)通路的激活對ST誘導(dǎo)人外周血單個核細(xì)胞中FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增多的影響:結(jié)果提示，SP600125預(yù)處理對ST誘導(dǎo)的FoxP3在蛋白和mRNA水平表達(dá)升高的作用沒有明顯影響。
　　 3.5.2 ERK信號傳導(dǎo)通路的激活對ST誘導(dǎo)人外周血單個核細(xì)胞中FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增多的影響:結(jié)果提示，PD98059預(yù)處理可以阻斷ST誘導(dǎo)的FoxP3在蛋白

15、和mRNA水平表達(dá)升高的作用。
　　 3.5.3 p38信號傳導(dǎo)通路的受抑制對ST誘導(dǎo)人外周血單個核細(xì)胞中FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增多的影響:結(jié)果提示，SB203580預(yù)處理可以促進(jìn)ST誘導(dǎo)的FoxP3在蛋白和mRNA水平表達(dá)升高的作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.一次腹腔注射ST處理24 h，可使BALB/c小鼠外周血單個核細(xì)胞中FoxP3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞數(shù)明顯增多，并且上調(diào)FoxP3在mRNA水平的表達(dá)。

16、r>　　 2.一次腹腔注射ST處理24 h，可使BALB/c小鼠胸腺和脾臟內(nèi)FoxP3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞數(shù)明顯增多，并且上調(diào)FoxP3在蛋白和mRNA水平的表達(dá)。
　　 3.腹腔注射ST對漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞的影響具有器官特異性?？墒笲ALB/c小鼠胸腺內(nèi)CD123+/BDCA2+漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞數(shù)明顯減少，而脾臟內(nèi)CD123+/BDCA2+漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞數(shù)明顯增多。同時可以下調(diào)BALB/c小鼠胸腺內(nèi)CD123和BDCA2

17、蛋白及CD123 mRNA的表達(dá)；而上調(diào)小鼠脾臟內(nèi)CD123和BDCA2蛋白及CD123 mRNA的表達(dá)。
　　 4.一次腹腔注射ST處理24 h，可使BALB/c小鼠皮膚CaN在蛋白和mRNA水平上的表達(dá)增高；但對Cc127的表達(dá)沒有明顯影響。
　　 5.一次腹腔注射ST處理24 h，可使BALB/c小鼠皮膚FoxP3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞增多，并且上調(diào)FoxP3在蛋白和mRNA水平上的表達(dá)。
　　 6.一次性給予

18、ST處理24 h，可使體外培養(yǎng)人外周血單個核細(xì)胞中FoxP3+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞數(shù)明顯增多，并且上調(diào)FoxP3在蛋白和mRNA水平的表達(dá)。
　　 7.一次性給予ST處理24 h，可以激活體外培養(yǎng)人外周血單個核細(xì)胞JNK和ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，同時抑制p38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　 8.給予JNK特異性阻斷劑SP600125預(yù)處理對ST誘導(dǎo)FoxP3的表達(dá)升高沒有影響；給予ERK特異性阻斷劑PD98059預(yù)處理可以阻斷ST對Fox