自然殺傷細(xì)胞及其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)隱球菌感染影響及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、第一部分自然殺傷細(xì)胞在隱球菌感染中的變化及其對(duì)隱球菌摩染病程的影響
　　 一、小鼠肺隱球菌感染模型以及NK細(xì)胞耗竭(NK cell depleted mice model)小鼠模型的建立
　　 目的：建立小鼠肺隱球菌感染模型以及NK細(xì)胞耗竭小鼠模型
　　 方法：C57BL/6小鼠經(jīng)腹腔注射2.5％Avertin麻醉后，于小鼠一側(cè)鼻孔內(nèi)緩慢滴入已調(diào)整濃度的菌液(接種量1×106/小鼠)。對(duì)照組小鼠經(jīng)小鼠一側(cè)鼻孔緩慢

2、滴入無菌PBS，觀察小鼠肺部病變、病理變化、臟器真菌載量。同時(shí)，C57BL/6小鼠予以腹腔注射anti-NK1.1單抗腹水(150μL/小鼠)，觀察小鼠脾細(xì)胞中NK細(xì)胞的變化。
　　 結(jié)果：經(jīng)鼻腔滴入隱球菌液后，小鼠肺部可見肉眼病灶，肺病理切片中可觀察到酵母菌，肺組織勻漿培養(yǎng)可見隱球菌菌落形成。小鼠經(jīng)anti-NK1.1單抗腹水處理后2天，脾細(xì)胞中NK細(xì)胞的比例明顯下降(>90％)，效果可持續(xù)10天以上。
　　 結(jié)論：通

3、過經(jīng)鼻滴入隱球菌液建立了小鼠肺隱球菌感染模型，經(jīng)腹腔注射anti-NK1.1單抗建立NK細(xì)胞耗竭小鼠模型。
　　 二、隱球菌感染時(shí)體內(nèi)自然殺傷細(xì)胞數(shù)量和功能變化的時(shí)相特征以及對(duì)于隱球菌感染病程的影響
　　 目的：系統(tǒng)探討隱球菌感染后感染灶局部和全身NK細(xì)胞數(shù)量和功能變化的時(shí)相特征，以及對(duì)于主要臟器的真菌載量和小鼠生存率的影響
　　 方法：使用小鼠肺隱球菌感染模型和NK細(xì)胞耗竭小鼠模型，將小鼠分為anti-NK1.

4、1未處理和處理組，觀察感染后第1、3、7、14天小鼠肺部及脾臟內(nèi)NK細(xì)胞數(shù)量、活化狀態(tài)、脫顆粒情況，觀察感染后第1、3、7、10、14天小鼠肺部和腦部真菌載量變化，觀察小鼠生存曲線的變化。
　　 結(jié)果：隱球菌感染后小鼠脾細(xì)胞總數(shù)、脾細(xì)胞中NK細(xì)胞數(shù)量、肺間質(zhì)白細(xì)胞總數(shù)、肺間質(zhì)白細(xì)胞中NK細(xì)胞數(shù)量均明顯增加，而小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞耗竭對(duì)于脾細(xì)胞總數(shù)無明顯影響，但可顯著影響感染第7天時(shí)肺間質(zhì)白細(xì)胞總數(shù)(P<0.05)。小鼠隱球菌感染后，

5、NK細(xì)胞表面CD69表達(dá)、CD107a的表達(dá)、胞內(nèi)IFNγ的分泌、胞內(nèi)perforin的表達(dá)在感染早期即明顯增加，以感染后第3天時(shí)最為明顯，隨后即逐漸下降。Anti-NK1.1未處理組小鼠隱球菌感染后肺部真菌載量在感染早期逐漸增加，感染后10天至14天最為明顯，其后有逐漸下降趨勢(shì)，而anti-NK1.1處理小鼠則隨感染時(shí)間延長而逐漸增加，兩組小鼠在感染第3天、第14天、第28天有顯著差異(P<0.05)。隱球菌感染小鼠在感染后7天左右腦

6、部勻漿真菌培養(yǎng)陽性，但兩組小鼠間無顯著差異(P>0.05)。與anti-NK1.1未處理組小鼠相比，anti-NK1.1處理組的小鼠死亡出現(xiàn)更早且死亡比例更高，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0007)。
　　 結(jié)論：隱球菌感染時(shí)，感染小鼠肺部和全身NK細(xì)胞數(shù)量明顯增加，NK細(xì)胞耗竭可影響肺部間質(zhì)白細(xì)胞總數(shù)。小鼠肺部隱球菌感染后，小鼠NK細(xì)胞均可被活化，NK細(xì)胞脫顆粒能力增強(qiáng)，且在感染后第3天時(shí)最為明顯。小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞耗竭后

7、可顯著增加感染早期和后期肺部真菌載量，但對(duì)腦部真菌載量無影響。體內(nèi)NK細(xì)胞耗竭后可顯著影響隱球菌感染小鼠的生存曲線。
　　 一、自然殺傷細(xì)胞在隱球菌感染時(shí)對(duì)適應(yīng)性免疫的影響
　　 目的：研究小鼠隱球菌感染時(shí)NK細(xì)胞對(duì)機(jī)體適應(yīng)性免疫反應(yīng)的影響。
　　 方法：使用小鼠肺隱球菌感染模型和NK細(xì)胞耗竭小鼠模型，將小鼠分為anti-NK1.1未處理和處理組，檢測(cè)小鼠感染后第7天、第14天時(shí)肺間質(zhì)白細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞內(nèi)IF

8、Nγ、IL-4分泌情況，測(cè)定小鼠感染后第7天、第14天時(shí)肺組織勻漿中IFNy、IL-4的水平。
　　 結(jié)果：小鼠肺隱球菌感染后第7天和第14天，肺間質(zhì)白細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞胞內(nèi)IFNv分泌均顯著增加(P<0.05)，呈逐漸上升趨勢(shì)。而肺間質(zhì)白細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞胞內(nèi)IL-4分泌于感染后第7天最顯著，至感染后第14天則較第7天有所下降。當(dāng)體內(nèi)NK細(xì)胞耗竭后，小鼠肺間質(zhì)白細(xì)胞中CD4+T胞IFNγ分泌較未處理小鼠顯著減少，而且在感染

9、第14天時(shí)較感染后第7天時(shí)無明顯增加，小鼠肺間質(zhì)白細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞IL-4分泌則逐漸增加。小鼠肺隱球菌感染后第7天和第14天，肺組織勻漿中IFNv水平均顯著增加，呈逐漸上升趨勢(shì)，而NK細(xì)胞體內(nèi)耗竭后，增加程度顯著下降(P<0.05)。小鼠肺隱球菌感染后第7天和第14天，肺組織勻漿中IL-4水平均顯著增加(P<0.05)，以感染后第7天最為明顯(P<0.05)，感染后第14天較感染后第7天顯著下降(P<0.05)。當(dāng)體內(nèi)NK細(xì)胞耗竭后

10、，肺組織勻漿中IL-4水平顯著增加，且感染后第14天較感染后第7天升高。
　　 結(jié)論：隱球菌感染后，機(jī)體誘導(dǎo)形成的Th1免疫反應(yīng)逐漸增強(qiáng)，Th2免疫反應(yīng)在感染后第7天則逐漸減弱。當(dāng)體內(nèi)NK細(xì)胞耗竭后，機(jī)體誘導(dǎo)形成的Th1免疫反應(yīng)雖逐漸增強(qiáng)，但程度明顯減弱，而Th2免疫反應(yīng)則明顯增強(qiáng)，從而影響機(jī)體的Th1/Th2平衡。
　　 二、自然殺傷細(xì)胞在隱球菌感染時(shí)對(duì)樹突狀細(xì)胞的影響
　　 目的：研究隱球菌感染時(shí)DC的成熟狀

11、態(tài)和功能，探討NK細(xì)胞對(duì)于上述變化的影響。
　　 方法：利用小鼠骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)的DC(BMDC)與熱滅活隱球菌共孵育，觀察BMDC的共刺激因子表達(dá)，檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-12p40和TNFα水平。使用小鼠肺隱球菌感染模型和NK細(xì)胞耗竭小鼠模型，將小鼠分為anti-NK1.1未處理和處理組，體內(nèi)觀察感染第7天時(shí)DC的表面共刺激因子的表達(dá)，檢測(cè)肺間質(zhì)白細(xì)胞中DC比例、數(shù)量、類型的變化，觀察，細(xì)胞的變化，測(cè)定肺組織勻漿中IL-12p40的

12、水平，以及NK細(xì)胞體內(nèi)耗竭對(duì)上述變化的影響。
　　 結(jié)果：BMDC與熱滅活隱球菌共孵育后，BMDC表面MHCⅡ、CD80、CD86表達(dá)均顯著增加，其培養(yǎng)上清也中IL-12p40和TNFα水平也顯著升高(P<0.05)。小鼠感染后第7天時(shí)，DC表面MHCⅡ、CD80、CD86表達(dá)均增加，以MHCⅡ最為顯著，當(dāng)體內(nèi)NK細(xì)胞耗竭后，MHCⅡ和CD86表達(dá)但較未處理的感染小鼠顯著下降，而CD80感染后表達(dá)無明顯增加。小鼠感染后第7天時(shí)，

13、肺間質(zhì)白細(xì)胞中DC的比例和絕對(duì)數(shù)量、CD45+CD11b+Gr-lint細(xì)胞的比例均明顯增加(P<0.05)，當(dāng)體內(nèi)NK細(xì)胞耗竭后，雖然DC比例和絕對(duì)數(shù)量以及CD45+CD11b+Gr-lint細(xì)胞仍高于未感染小鼠，但顯著低于未處理小鼠(P<0.05)。小鼠隱球菌感染后，肺間質(zhì)白細(xì)胞中DC的類型均以mDC為主，兩組間無明顯差異(P>0.05)。小鼠肺隱球菌感染后第7天，肺組織勻漿中IL-12p40水平顯著上升，但體內(nèi)NK細(xì)胞耗竭時(shí)IL-

14、12p40水平可顯著降低(P<0.05)。
　　 結(jié)論：隱球菌感染后增加感染灶中DC的比例和數(shù)量，誘導(dǎo)DC的成熟，增加細(xì)胞因子分泌，促進(jìn)機(jī)體Th1免疫反應(yīng)形成。隱球菌感染后感染灶中DC以mDC為主。隱球菌感染時(shí)，感染灶中DC前體細(xì)胞增加，可使感染灶中DC數(shù)量增加。體內(nèi)NK細(xì)胞耗竭后，DC感染灶中DC前體細(xì)胞比例、DC的比例和數(shù)量、DC的成熟狀態(tài)機(jī)細(xì)胞因子的分泌均受到影響，由此可能影響Th1免疫反應(yīng)的形成，但DC的類型無明顯改變。