白細(xì)胞介素21對(duì)SHIV感染恒河猴外周血CD8+ T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)是由人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)侵犯并破壞機(jī)體免疫系統(tǒng)引起的疾病。自高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法出現(xiàn)以后，發(fā)現(xiàn)受損的免疫功能可以得到部分重建。隨著研究的深入，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注免疫重建機(jī)制的相關(guān)研究。其中，改善CD8+T細(xì)胞的效應(yīng)功能逐漸成為研究熱點(diǎn)。目前，如細(xì)胞因子治療等一些治療的新策略已逐步進(jìn)入試驗(yàn)或臨床階段，這為改善患者的免疫功能提供新的手段和理念。
　　 IL-21與HIV/SIV/SHIV感染之間存在

2、著密切的聯(lián)系。白細(xì)胞介素21（interleukine21，IL-21）是一種新近發(fā)現(xiàn)的、主要由活化的CD4+T細(xì)胞分泌的、具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子。人或非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物感染了HIV/SIV/SHIV后，主要表現(xiàn)為CD4+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)的減少。在HIV感染的急性期，病毒特異性CD8+T細(xì)胞優(yōu)先大量擴(kuò)增，這有助于控制病毒的復(fù)制。IL-21對(duì)CD8+T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用備受學(xué)者們關(guān)注。同時(shí)，HIV的急性感染造成了“細(xì)胞因子風(fēng)暴”。但就HIV感

3、染者早期的免疫狀況，存在難于明確HIV感染時(shí)間等諸多瓶頸。迄今，尚未見(jiàn)到有關(guān)HIV/SIV/SHIV急性感染期血清/血漿IL-21水平動(dòng)力學(xué)的研究報(bào)道，SHIV/中國(guó)恒河猴艾滋病模型的應(yīng)用使之迎刃而解。此外，IL-21在SHIV感染中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制尚未闡明。
　　 目前為止，盡管一些細(xì)胞因子在抗HIV/SIV/SHIV感染中發(fā)揮積極的作用，但在臨床應(yīng)用上也遇到了一些阻礙，其中面臨的最大障礙是細(xì)胞因子亦能促進(jìn)CD4+T細(xì)胞內(nèi)的病

4、毒復(fù)制。因此，作為潛在的治療劑和疫苗佐劑，很有必要評(píng)價(jià)IL-21對(duì)SHIV感染CD4+T細(xì)胞的影響。本研究包括以下三部分:
　　 一、SHIV感染恒河猴急性期血漿白細(xì)胞介素21的動(dòng)態(tài)變化
　　 為了檢測(cè)SHIV-1157ipd3N4感染急性期不同時(shí)間點(diǎn)血漿IL-21濃度和體內(nèi)的主要免疫學(xué)指標(biāo)的動(dòng)力學(xué)變化，分析IL-21水平與其它指標(biāo)的相關(guān)性，本課題定時(shí)采集22只SHIV感染恒河猴的外周血，檢測(cè)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)

5、胞絕對(duì)數(shù)、HIV RNA水平、T細(xì)胞活化程度，以及IL-21和IFN-γ表達(dá)水平。我們首次報(bào)道，SHIV感染急性期血漿IL-21水平顯著高于感染前的基礎(chǔ)水平，并且IL-21的水平與IFN-γ和CD4+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)呈一定程度的正相關(guān)，但與CD8+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)無(wú)關(guān)。這一結(jié)果提示IL-21可能參與了HIV/SIV/SHIV抗病毒免疫應(yīng)答，從而推測(cè)IL-21在免疫重建中起重要作用。
　　 二、白細(xì)胞介素21對(duì)SHIV感染猴CD8+T細(xì)胞

6、免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究
　　 SHIV感染急性期產(chǎn)生大量的IL-21，與其受體結(jié)合后引起一系列生物學(xué)效應(yīng)。為了研究IL-21對(duì)SHIV感染猴外周血CD8+T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。接下來(lái)我們利用體外實(shí)驗(yàn)對(duì)IL-21免疫調(diào)節(jié)CD8+T細(xì)胞的效應(yīng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　 加入IL-21，檢測(cè)SHIV感染猴外周血CD8+T細(xì)胞的IL-21R、IFN-γ、穿孔素和顆粒酶素B以及CD107a表達(dá)水平、T細(xì)胞增殖和凋亡水平

7、，以及JAK/STAT信號(hào)通路中蛋白磷酸化水平的變化。結(jié)果表明，10ng/mLIL-21刺激CD8+T細(xì)胞后IFN-γ的分泌明顯高于未刺激組(P＜0.05)，real time PCR檢測(cè)IFN-γ mRNA的表達(dá)明顯升高，4h為刺激CD8+T細(xì)胞胞內(nèi)IFN-γ合成的最佳時(shí)間。IL-21誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞中穿孔素和顆粒酶素B的釋放，伴隨著CD107a+CD8+T細(xì)胞百分比的上升，與培養(yǎng)基對(duì)照組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;IL-21能有效地增強(qiáng)

8、CD8+T細(xì)胞的殺傷功能;IL-21是CD4+T細(xì)胞增殖的弱誘導(dǎo)劑，對(duì)CD4+和CD8+T細(xì)胞的凋亡均無(wú)明顯影響。SHIV感染恒河猴外周血CD8+T細(xì)胞經(jīng)IL-21刺激后，CD8+T細(xì)胞表面表達(dá)的IL-21R顯著上調(diào);同時(shí)，我們也檢測(cè)到CD8+T細(xì)胞內(nèi)pSTAT3的表達(dá)水平顯著增加。本研究證實(shí)，IL-21增強(qiáng)了活化CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制可能與其通過(guò)激活STAT3信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫有關(guān)。
　　 三、IL-2

9、1對(duì)SHIV感染CD4+T細(xì)胞的影響
　　 上述研究表明，IL-21及其受體參與CD8+T細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)。因此，作為潛在的免疫治療劑，體外評(píng)價(jià)IL-21對(duì)SHIV感染CD4+T細(xì)胞的影響是很有必要的。本部分研究分別比較IL-21誘導(dǎo)組、IL-2誘導(dǎo)組和培養(yǎng)基對(duì)照組的CD4+T細(xì)胞表面CD69、Ki67和P27的表達(dá)，以及T細(xì)胞亞群比例的變化。結(jié)果表明，IL-21誘導(dǎo)組和培養(yǎng)基對(duì)照組CD4+T細(xì)胞表面CD69的表達(dá)率分別為(0.2

10、8±0.047)％和(0.25±0.003)％，明顯低于IL-2組(2.03±0.97)％(P＜0.05); IL-21刺激后T細(xì)胞亞群比例無(wú)明顯改變;IL-21組的Ki67+CD4+T細(xì)胞所占的百分比[（1.35±0.18）％]高于培養(yǎng)基對(duì)照組，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;5、10、50、100和200μg/mL IL-21誘導(dǎo)的表達(dá)P27的CD4+T細(xì)胞的百分率分別為（0.56±0.06）％、(0.85±0.11)％、（0.89±0.09）％

11、、(0.88±0.19)％和（1.03±0.25）％，與培養(yǎng)基對(duì)照組（0.47±0.04）％相比，差異均不顯著。結(jié)果表明IL-21促進(jìn)CD4+T細(xì)胞表達(dá)P27的能力很弱，且不呈劑量依賴(lài)效應(yīng)。此外，20 U/mL和40 U/mL IL-2誘導(dǎo)的表達(dá)P27的CD4+T細(xì)胞占全部CD4+T細(xì)胞的百分率分別為（3.89±0.32）％和(8.08±1.02)％，均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。這一結(jié)果證實(shí)，與IL-2相比，IL-21不能顯著提高