雞白細(xì)胞介素2受體在RNA病毒感染過程中的免疫調(diào)節(jié)分析.pdf

1、本文從如下四個(gè)方面進(jìn)行論述：
　　 1、chIL-2R基因的克隆與體外重組表達(dá)
　　 依據(jù)雞白細(xì)胞介素-2受體亞基α鏈(chCD25)、β(chCD122)、γ(chCD132)的cDNA序列設(shè)計(jì)特異性引物,通過RT-PCR分別擴(kuò)增和克隆了chCD25、chCD132 cDNA全長(zhǎng)序列及chCD122部分cDNA序列。chCD25和chCD132cDNA的長(zhǎng)度分別為1027 bp和1047 bp,各自編碼由211和348

2、個(gè)氨基酸(aa)殘基所組成的前體蛋白。chCD122 cDNA片段長(zhǎng)度為660bp,編碼該蛋白的部分胞外區(qū)序列。chCD25成熟蛋白由胞外區(qū)(172aa)、跨膜區(qū)(15aa)和胞漿區(qū)(4aa)三部分組成。chCD132成熟蛋白由由胞外區(qū)(210aa)、跨膜區(qū)(23aa)和胞漿區(qū)(94aa)三部分組成?；蚨ㄎ环治鲲@示,chCD25基因位于雞染色體1,由五個(gè)外顯子和四個(gè)內(nèi)含子組成。chCD122基因也位于雞染色體1,由12個(gè)外顯子和11個(gè)

3、內(nèi)含子組成。chCD132基因位于雞染色體4,由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成;chCD25和chCD122在基因結(jié)構(gòu)上與人和鼠的相應(yīng)基因差異較大,而chCD132的則與人、鼠相似。這些結(jié)果說明,雞白細(xì)胞介素-2受體(chIL-2R)基因具有明顯的種屬特異性。
　　 將編碼chCD25、chCD132的胞外區(qū)序列及chCD122部分胞外區(qū)序列,分別插入pET32a或pET28a原核表達(dá)載體。經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定后,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(

4、DE3),在1 mM IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)4h。SDS-PAGE和Western blot鑒定的結(jié)果顯示,chCD25、chCD122和chCD132蛋白被表達(dá),它們的分子量大小分別為38 Kda、30 Kda、28 Kda。通過Ni柱變性純化的方法,獲得純度較高的chCD25、chCD122和chCD132原核蛋白。
　　 2、chIL-2R單克隆抗體制備與功能驗(yàn)證
　　 以原核表達(dá)的chCD25、chCD122和ch

5、CD132重組蛋白為免疫原,免疫BALB/c小鼠,分別獲得了7株(4H5、6C9、6A1、5El、1G1、6C2、1E1)能穩(wěn)定分泌抗chCD25單克隆抗體(mAbs)的細(xì)胞、4株(1G11,5A5,5812,2C11)穩(wěn)定分泌抗chCD122單克隆抗體的細(xì)胞、6株(1A1、1G11、1B9、3G11、F8、C10)穩(wěn)定分泌抗chCD132單克隆抗體的細(xì)胞。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,所有抗體細(xì)胞分泌的細(xì)胞上清均能與相應(yīng)的重組

6、蛋白發(fā)生反應(yīng)。chIL-2R基因轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)或熒光檢測(cè)證實(shí),除chCD122的mAb5B12和chCD132的mAb1A1外,所有mAb均能真核細(xì)胞表達(dá)的chIL-2R蛋白反應(yīng)。用Con A誘導(dǎo)的體外淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)證實(shí),制備的chCD25 mAbs(5E1和6C9)、chCD122 mAbs(5A5、1G11、2C11)及chCD132 mAb(C10)能結(jié)合淋巴細(xì)胞表面的蛋白分子。體外淋巴細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)的研究表明,c

7、hCD25 mAb6C9能有效地抑制雞白細(xì)胞介素-2(chIL-2)激活T淋巴細(xì)胞的增殖作用,并呈濃度依賴性。此提示,本文獲得的chCD25基因是特異性針對(duì)chIL-2的。
　　 3、IBDV感染條件下的chIL-2R調(diào)節(jié)功能分析
　　 以IBDV感染雞胚成纖維細(xì)胞,感染后不同時(shí)間點(diǎn),在mRNA和蛋白水平分析chIL-2R及chCD132關(guān)聯(lián)細(xì)胞因子的變化。結(jié)果顯示,IBDV感染能激活CEF中chCD25、chCD122

8、、chIL-2、雞白細(xì)胞介素-4(chIL-4)、雞白細(xì)胞介素-7(chIL-7)、雞白細(xì)胞介素-9(chIL-9)、雞白細(xì)胞介素.15(chIL-15)的mRNA轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào),但CD132的mRNA轉(zhuǎn)錄處于抑制狀態(tài)。與mRNA檢測(cè)相對(duì)應(yīng),在IBDV體外感染48小時(shí)的CEF可檢測(cè)到chCD25和chCD122蛋白的表達(dá),不能檢測(cè)到chCD132蛋白的表達(dá)。
　　 以致病性IBDV感染SPF雞,在mRNA和蛋白水平分析chIL-2

9、R及chCD132關(guān)聯(lián)細(xì)胞因子的變化,結(jié)果顯示:胸腺組織中chCD25、chCD122、chCD132、chIL-2、chIL-4、chIL-7、chIL-9、chIL-15的mRNA轉(zhuǎn)錄被顯著抑制;與胸腺組織相反,法氏囊和脾臟組織中chCD25、chCD122的mRNA轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào),chCD132的mRNA轉(zhuǎn)錄上調(diào)維持在較低水平,以法氏囊最不明顯。與mRNA檢測(cè)相對(duì)應(yīng),在IBDV感染的法氏囊及脾臟淋巴細(xì)胞表面可檢測(cè)到chCD25和ch

10、CD122的表達(dá),不能檢測(cè)到chCD132蛋白的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)顯示,IBDV體內(nèi)感染顯著抑制了胸腺細(xì)胞chCD25、chCD122和chCD132亞基的表達(dá),明顯激活了法氏囊細(xì)胞chCD25和chCD122亞基的表達(dá),但法氏囊細(xì)胞chCD132的mRNA基本沒有明顯變化。因此,我們可以確信,IBDV感染過程中chIL-2R對(duì)細(xì)胞免疫中樞和體液免疫中樞的調(diào)控機(jī)制是不同的。
　　 在非免疫組織中,IBDV感染后,腦、十二指腸、空腸組

11、織中的chCD25、chCD122、chCD132在感染后表達(dá)下調(diào);腺胃、盲腸、腎、肺及胰組織組織中的chCD25、chCD122、chCD132在感染后表達(dá)逐漸上調(diào);肌胃組織中的chCD25、chCD122、chCD132處于初期的下調(diào)、中期上調(diào)和末期下調(diào);肝組織中chCD122和chCD132在感染后表達(dá)上調(diào),而chCD25處于初期上調(diào),中末期下調(diào);心組織中chCD132在感染后表達(dá)上調(diào),而chCD25處于初期上調(diào)、中期下調(diào)和末期上

12、調(diào),chCD122處于初期下調(diào),中末期上調(diào)。與chIL-2R關(guān)聯(lián)的chIL-4 mRNA轉(zhuǎn)錄在腦抑制、在腎上調(diào),chIL-7 mRNA轉(zhuǎn)錄在肌胃上調(diào)、在腺胃抑制,chIL-2、chIL-7、chIL-9 mRNAs的轉(zhuǎn)錄在十二指腸抑制、在盲腸上調(diào),chIL-15 mRNA轉(zhuǎn)錄在十二指腸上調(diào)、在空、盲腸抑制。chIL-2、chIL-7、chIL-9、chIL-15 mRNAs的轉(zhuǎn)錄在空腸抑制和在盲腸、心臟上調(diào)。這些結(jié)果證明,IBDV感染后

13、chIL-2R在不同的非免疫組織的調(diào)控機(jī)制也是不同的。
　　 4、HSN1感染條件下的chIL-2R調(diào)節(jié)功能分析
　　 以H5N1感染CEF,感染后不同時(shí)間點(diǎn),在mRNA和蛋白水平chIL-2R及chCD132關(guān)聯(lián)細(xì)胞因子的變化。結(jié)果表明,H5N1病毒感染CEF后,能引起細(xì)胞內(nèi)chIL-2R和chCD132細(xì)胞因子mRNAs表達(dá)上調(diào)。IL-2R蛋白水平的間接免疫熒光可檢測(cè)到chCD25、chCD122和chCD132的表

14、達(dá)。此結(jié)果顯示,IBDV和H5N1感染過程中對(duì)chCD132調(diào)控是不同的。
　　 以H5N1感染SPF雞,感染后不同時(shí)間在mRNA和蛋白水平分析chIL-2R及chCD132關(guān)聯(lián)細(xì)胞因子的變化,結(jié)果表明,脾臟組織中chCD25、chCD122、chCD132的mRNA明顯上調(diào),法氏囊組織中僅出現(xiàn)chCD25和chCD132的mRNA上調(diào),與此相反,胸腺組織中的chCD25、chCD122和chCD132的mRNA均顯著下調(diào)。免疫

15、組織化學(xué)檢測(cè)也證實(shí),脾臟組織中的chCD25+、chCD122+和chCD132+細(xì)胞的數(shù)量多于法氏囊組織,胸腺組織中不能檢測(cè)到chCD25+、chCD122+和chCD132+細(xì)胞。與之相對(duì)應(yīng)的配體chIL-2、chIL-4在脾臟和胸腺中也出現(xiàn)了顯著上調(diào),在法氏囊中出現(xiàn)下調(diào),說明H5N1病毒感染不僅導(dǎo)致了胸腺中chIL-2R+細(xì)胞從免疫中樞-胸腺向外周免疫器官的移動(dòng),同時(shí)啟動(dòng)了機(jī)體的TH1和TH2細(xì)胞免疫應(yīng)答。就與chCD132相關(guān)聯(lián)

16、的其他細(xì)胞因子而言,chIL-15的mRNA在脾臟、胸腺、法氏囊組織中轉(zhuǎn)錄無不明顯變化,說明chIL-15未能在機(jī)體抵抗H5N1的感染過程中發(fā)揮作用。chIL-7的mRNA在脾和法氏囊組織上明顯上調(diào),在胸腺中變化不明顯,說明H5N1感染過程中chIL-7在維持外周T細(xì)胞的自我平衡過程發(fā)揮了重要作用。
　　 綜合上述,H5N1病毒感染引起了免疫中樞chCD25、chCD122和chCD132分子的表達(dá)下調(diào),外周免疫組織的上調(diào),導(dǎo)致